天然药物系统预试验操作方法总结

天然药物系统预试验操作方法总结中草药主要来源于植物。植物的化学成分较复杂，有些成分是植物所共有的，如纤维素、蛋白质、油脂、淀粉、糖类、色素等。有些成分仅是某些植物所特有的，如生物碱类、苷类、挥发油、有机酸、鞣质等。各类化学成分均具有一定的特性，一般可由药材的外观、色、嗅、味等作为初步检查判断的手段之一。如药材样品折断后，断面不油点或挤压后有油迹者，多含油脂或挥发油；有粉层的多含淀粉、糖类；嗅之有特殊气味者，大多含有挥发油、香豆精、内酯；有甜味者多含糖类；味苦者大多含生物碱、苷类、苦味质；味酸者含有有机酸；味涩者多含有鞣质等等。中草药所含化学成分均为多类的混合物，分析时常常互相干扰，不易得到正确结果。因此需根据中草药所含各种化学成分的溶解度、酸碱度、极性等理化性质，再用各类成分的鉴别反应加以鉴别。对未知成分的中草药，在分离其有效成分之前，作初步检查，籍及了解其中所含成分的概貌是很有必要的。预试验主要有两类方法：一类是单项试验法即根据工作需要，有重点地检查其某类成分；另一类是系统预试法，应用一些简单的定性试验，即对中草药中各类成分进行比较全面的定性检查。方法：试管反应+色谱鉴别（纸色谱+薄层层析）1预试溶液的制备系统预试方法很多，常采用的为递增极性溶剂法，就是根据中草药成分亲脂性强弱，选用各种极性不同的溶剂，依次进行提取，使其分为若干部分，并按其可能存在的成分选择适当的鉴别反应。最后做出较合理的判断。方法一：将药材直接放入连续加热回流提取器中，依次用石油醚、乙醚或氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇或甲醇、水回流提取，将药材按照极性的大小由小至大分成（I〜W），加压回收溶剂，浓缩干燥，即得。这七部分所含化学成分大体如下：I石油醚部分一一挥发油、萜类、甾体、脂肪油等；II氯仿部分一一生物碱（叔胺碱、仲胺碱）、黄酮类、游离香豆素和内酯、游离木质素、游离醌类、萜类、甾体皂苷元、脂肪酸、环肽等；III乙酸乙酯部分一一游离醌类、黄酮、少量强心苷等；IV水饱和正丁醇部分一一多数苷类；V丙酮部分一一强心苷等；W95%乙醇部分一一多数苷类（醌苷、香豆素苷）、游离木质素、黄酮及其苷、萜及萜苷、强心苷、甾体皂苷及皂苷元、鞣质、氨基酸、环肽、生物碱（季铵碱、碱盐、某些含N-O结构生物碱）等；训水部分一一黄酮、三帖皂苷、强心苷、甾体皂苷、生物碱（季铵碱、碱盐、某些含N-O结构生物碱）、鞣质、氨基酸、环肽、蛋白质、多糖。Anastasia.HanOct.19tlj2008方法二：将药材样品先用70-95%的乙醇进行回流提取，然后回收乙醇补加水至1：1体积，再分别用石油醚、氯仿或乙醚、乙酸乙酯、正丁醇，分取有机层；其药渣再以水煎煮，便可得到五部分（I〜V），大体成分如下：I石油醚层一一油脂、叶绿素、亲脂苷元、甾醇等；II氯仿层一一生物碱、脂肪酸、多数苷元等；III乙酸乙酯层一一亲脂性单糖苷、酚性物、极性大的苷元等；IV正丁醇层一一多数苷类、水溶性生物碱；V水层一一糖、氨基酸、可水解性鞣质等。W水煎液一一大分子蛋白质、粘液质、多糖等。方案三：先用甲醇、丙酮等弱亲脂性溶剂提出绝大多数成分，然后用酸性水溶液温浸提出多糖、蛋白质等，总提取物再进一步用溶剂提取，分出酸性、碱性、中性成分、水蒸汽蒸馏分出挥发性成分。方案四：将药材样品先用水煎煮法进行提取，滤液浓缩成1：1或1：2体积后，分别以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得四部分。减压回收溶剂，浓缩成浸膏，即得。因为中药复方多为汤剂有效，所以这种提取分离方法适合于中药复方有效部位的筛选。2鉴别注意事项2.1根据各灰成分不同性质，选用适宜的溶剂提取，以保证等成分能被提取出来。2.2检品提取液的浓度应足以达到各该反应的灵敏度。2.3检品提取液的酸碱度（pH）值应不致影响鉴别反应中所需要的pH值。相差甚大时应事先调节。2.4提取液较深时，常易影响观察鉴别反应的效果，此时可适当稀释，或进一步提纯。2.5鉴别反应时应注意防止多类成分的相互干扰，以免出现假阳性，或颜色不正等情况。最好在化学鉴别的同时，做空白试验和对照试验（用已知含某类成分的中草药或纯品做阳性对照）。2.6在鉴别试验中，如果某一类成分的几个鉴别反应结果不一致时（即有的呈阳性反应，有的呈阴性）则应进行全面分析。首先应注意呈阳性反应的试验是否属于该类成分的专一反应，否则应检查其他类成分能否产生该反应，从多方面加以判断。但也应注意，某些反应只能对某一类成分中的某个化学基团呈性反应，如检查黄酮类的盐酸一一镁粉试验，它只对黄酮类中的羟基黄酮类（黄酮醇类）反应明显，其余类的黄酮类则不甚明显，但也不能轻易否定不是黄酮类，为了避免孤立和片面的下结论，一定要全面考虑综合分析。中草药化学成分一般鉴别试验只是一个初步判断，最后确证尚需进一步提纯，以鉴定后才能予以肯定。3鉴别方法3.1挥发油、油脂挥发油一一主要溶于石油醚、乙醚、二硫化碳、油脂等；在高浓度乙醇中能全部溶解，在低浓度乙醇中只能溶解一部分。油脂一一易溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿、汽油等有机溶剂。1油斑试验：将石油醚提取液滴于滤纸上，室内挥发。能自然挥发或加热后挥发者可能为挥发油；如果出现持久性的透明斑点，可能为油脂或类脂。3.1.2香草醛-60%浓硫酸试验：将石油醚提取液滴于滤纸或薄层板上，喷洒试剂，如显紫、蓝、黄、红色可能含挥发油（对某些酚类、萜类、甾体和甾醇等皆可显色）。3.1.3磷钼酸试验：将石油醚提取液滴于滤纸上，喷洒25%磷钼酸试液，放入115-118°C烘箱中2min，如呈现黄色，背景为黄绿色或藏青色，表明可能含有还原性物质、甾体、类脂；若喷洒5%磷钼酸试液一蓝色（油脂、三萜、甾醇）3.1.4丙烯醛试验：将试液3滴和倍量无水NaSO4固体置于试管中，直火加热，甘油和甘油脂类能生成有刺激臭味的丙烯醛。（可用斐林试剂检查）3.1.5显色反应：挥发油中3.1.5.1若含有酚类成分，加入三氯化铁的乙醇溶液，可产生蓝色、蓝紫色或绿色反应；3.1.5.2若含有羰基化合物，加入苯肼或苯肼衍生物、羟胺等试剂，可生成结晶性的衍生物；3.1.5.3若含有醛类化合物，加入硝酸银氨试液，可发生银镜反应；3.1.5.4若含有内酯类化合物，于样品的毗啶溶液中加入亚硝酰铁氰化钠及氢氧化钠溶液，出现红色并逐渐消失；3.1.5.5若含有不饱和化合物，于样品中加入漠，红棕色褪去；3.1.5.6若含有奥类衍生物，加入浓硫酸，可产生蓝色或紫色反应。3.1.6薄层色谱法挥发油成分薄层色谱的条件主要是根据极性大小加以分离的。油中所含各类化合物的极性顺序为：烃（萜）〈醚＜酯〈醛、酮〈醇、酚〈酸，因此，可试用不同极性的展开剂进行分离。吸附剂一一硅胶、氧化铝，其中以硅胶常用。展开剂一一不含氧的烃类成分一一石油醚或正己烷含氧化合物一一石油醚或正己烷：乙酸乙酯（85：15）显色剂一一①香草醛-浓硫酸试剂：与挥发油中各成分产生多种鲜艳的颜色。2%高锰酸钾水溶液：在粉红色背景产生黄色斑点时表明含不饱和化合物。荧光素-漠试剂：在长波长的紫外光灯下观察，如薄层斑点显黄色荧光，则表明含乙烯基化合物。2.4-二硝基苯肼试剂：喷试剂后如产生黄色斑点表明可能含有醛或酮类化合物。异羟肟酸铁试剂：喷试剂后如产生淡红色斑点表明含有内酯类化合物。三氯化铁试剂：斑点显蓝色或绿色，含有酚性物质。0.05%漠酚蓝乙醇溶液：斑点显黄色表明含酸类物质。硝酸铈铵试剂：在黄色背景上显棕色斑点，表明含有醇类物质。对二甲氨基苯甲醛试剂：在80°C加热10分钟，显深蓝色，可能含类物质。碘化钾-冰醋酸-淀粉试剂：斑点显蓝色表明含过氧化物。3.2萜类萜类一一难溶于水，溶于甲醇、乙醇，易溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯等亲脂性有机溶剂。具有羧基、酚羟基及内酯结构的萜还可以分别溶于碳酸氢钠或氢氧化钠水溶液，加酸之后使之游离或环合，又可以从水中析出或转溶于亲脂性有机溶剂。萜苷一一一般能溶于热水，易溶于甲醇及乙醇，不溶于或难溶于亲脂性有机溶剂。3.2.1卓酚酮类3.2.1.1三氯化铁反应：与1%的三氯化铁溶液反应生成赤色络合物。3.2.1.2硫酸铜反应：与稀硫酸铜溶液反应生成稳定的绿色结晶。此结晶可用氯仿重结晶，并具有高熔点。3.2.2环烯醚苗类Weiggering反应：取新鲜药材1g，适当切碎，加入1%盐酸5ml，浸渍3-6小时，取此浸渍液（上清液）0.1ml转移至装有Trim-Hill试剂（乙酸10ml、0.2%硫酸铜水溶液1m1、浓硫酸0.5ml混合液）试管内，混匀，加热至产生不同颜色。Shear反应：Shear试剂（浓盐酸：苯胺=1：15）多能与毗喃衍生物产生特有的颜色。3.2.3奥类化合物Sabety反应：取挥发油1滴溶于1ml氯仿溶液中，加入5%漠的氯仿溶液数滴，若产生绿、紫或绿色，表明含有奥类衍生物。Ehrlich试剂反应：取挥发油适量与Ehrlich试剂（对-二甲胺基苯甲醛-浓硫酸试剂）反应，若产生紫色或红色，表明含有奥类衍生物。3.2.3.3对-二甲胺基苯甲醛显色反应：挥发油经薄层色谱展开后，再喷以由对-二甲胺基苯甲醛0.25g、乙酸50g、85%磷酸5g和水20ml混匀后组成的显色剂（避光可保存数月），室温显蓝色，示有奥类衍生物；氢化奥80C加热10min显蓝色。蓝色随后减弱转为绿色，最后转为黄色，将薄层放在水蒸气上则蓝色可现。3.2.3.4色谱检识吸附剂：硅胶G、氧化铝G及此二种吸附剂与硝酸银组成的络合吸附剂展开剂：石油醚（30-60C）、乙烷、苯，分别加入不同比例的乙酸乙酯或乙醚，极性大的萜醇或萜酸类可加入氯仿或甲酸、乙酸展开分离。显色剂：通用显色剂一一硫酸、香兰素-浓硫酸、茴香醛-浓硫酸、五氯化锑、三氯化锑、碘蒸气、磷钥酸；专属显色剂一一2,4-二硝基本肼（检识醛、酮类化合物）、邻联茴香胺。3.2.4三萜及三萜皂昔游离三萜类一一溶于石油醚、乙醚、氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂，而不溶于水。三萜皂苷一一可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇、热乙醇中，几乎难溶于或不溶于丙酮、乙醚及石油醚等极性小的有机溶剂；在含水正丁醇或戊醇中溶解度较好。3.2.4.1泡沫试验：取检品的水溶液2ml于带塞试管中，用力振摇3分钟，即产生持久性蜂窝状泡沫（维持10分钟以上），且泡沫量不少于液体体积的1/3。【注】①常用的增溶剂吐温、司盘，振摇时均能产生持久性泡沫，要注意区别。②另取两支试管，各加试品热水溶液1ml，一管内加5%NaOH液2ml溶液。另一管加人5%盐酸溶液2m1，将两试管用力振摇一分钟观察两管出现泡沫情况，如两管的泡沫高度相似，表明为三萜皂甙，如含碱液管比含酸液管的泡沫高达数倍，表明有甾体皂甙。三萜皂甙为酸性皂甙在酸性水溶液中形成较稳定的泡沫；甾体皂甙为中性皂甙在碱性溶液中能形成较稳定的泡沫。3.2.4.2显色反应3.2.4.2.1醋酐-浓硫酸试验（Liebrmann-Burchard反应）：取检品的水溶液置蒸发皿中，于水浴上蒸干，残渣加入少量冰醋酸使溶解，再加入醋酐-浓硫酸（19：1）试液，呈现红紫色并变成污色绿色（甾类、三萜类成分或皂苷）。【注】黄-红-紫红色-蓝-褪色（三萜皂苷）黄-红-紫-污绿（甾体皂苷）3.2.4.2.2三氯醋酸反应（Rosen-Heimer反应）：将样品液滴加在滤纸上，喷25%的三氯乙酸乙醇溶液，加热至100°C；加热至60°C猩红色逐渐变成紫色，为甾体皂苷。3.2.4.2.3冰醋酸-乙酰氯反应（Tschugaeff反应）：将样品溶解于冰醋酸中，加乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈淡红色或紫红色。3.2.4.2.4氯仿-浓硫酸反应（Salkowski反应）：将样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在浓硫酸层呈现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现。3.2.4.2.5Kahlenberg反应将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20%五氯化锑或三氯化锑的氯仿溶液，干燥后，60-70C加热，显蓝色、灰蓝色、灰紫色等多种颜色。3.2.4.3溶血试验：取试管4支，分别加入滤液0.25、0.5、0.75ml，然后依次分别加入生理盐水2.25、2.0、1.75、1.5ml，使每一个试管中的溶液都成为2.5ml,再将各试管加入2%的血细胞悬液2.5ml，振摇均匀后，同置于370水浴或25-270的室温中注意观察溶血情况，一般观察3小时即可，或先滴红细胞于显微镜下，然后滴加检液看血细胞是否消失。如有溶血现象示正反应。【注】①鞣质对血红细胞有凝集作用，干扰溶血试验的观察，应事先除去（可用取胜酰胺粉吸附或用明胶沉淀）。检液应为中性溶液。浓硫酸、高氯酸、高氯酸-香草醛、浓硫酸-香草醛等的显色原理主要是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色3.2.4.4色谱检识3.2.4.4.1色谱检识：薄层色谱一一吸附剂一一硅胶展开剂一一游离三萜化合物一一环己烷：乙酸乙酯（1：1）、氯仿：乙酸乙酯（1：1）、苯：丙酮（1：1）、氯仿：丙酮（1：1）等亲脂性有机溶剂。皂苷一一氯仿：甲醇：水（65：35：10,下层）、正丁醇：乙酸：水（4：1：5,下层）、乙酸乙酯：吡啶：水（3：1：3）、乙酸乙酯：乙酸：水（8：2：1）等。显色剂一一10%硫酸溶液、三氯乙酸、五氯化锑、香草醛-硫酸试剂等。纸色谱一一亲脂性皂苷一一固定相一一水流动相一一乙酸乙酯：吡啶：水（3：1：3）、正丁醇：乙酸：25%氨水（10：2：5）、正丁醇：乙醇：15%氨水（9：2：9）等。游离三萜和亲脂性皂苷固定相：甲酰胺展开剂：甲酰胺饱和氯仿溶液、氯仿：四氢吠喃：吡啶（10：10：2,下层，预先以甲酰胺饱和）、氯仿：二氧六环：吡啶（10：10：3,下层，预先以甲酰胺饱和）等。显色剂：三氯乙酸、五氯化锑试剂等。3.3氨基酸、多肽、蛋白质氨基酸一一多数氨基酸易溶于水，难溶于有机溶剂，如丙酮、氯仿、乙醚等。多肽一一易溶于水，可溶于甲醇、氯仿等有机溶剂。蛋白质和酶一一多数溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质的溶解度受pH值影响。3.3.1氨基酸的检识供试液的制备：取中药粗粉1-2g，加水10-20ml温浸1h，滤过。3.3.1.1茚三酮试验：供试液1ml，加入0.2%茚三酮试液2-3滴，加热煮沸4—5分钟，待其冷却，呈现蓝或蓝紫色（氨基酸、多肽、蛋白质）。【注】①茚三酮试剂主要是多肽和氨基酸的显色剂，反应在1小时内稳定。试剂溶液pH值以5—7为宜，必要时可加吡啶数滴或醋酸钠调整。②此反应非常灵敏，但有个别氨基酸不能呈紫色，而呈黄色，如脯氨酸、海人草氨酸。氨也有反应，因此要注意氨气的干扰。Isatin反应：取供试液滴于滤纸上，晾干，喷洒吲哚醍试液，加热5min，各种不同的氨基酸呈现不同的颜色。Folin试剂：取1，2-萘醍-4-磺酸钠0.02g溶于5%碳酸钠溶于100ml，临用现配。不同氨基酸显示不同的颜色。3.3.1.4加热或矿酸试验：取检品的水溶液1ml于试管中，加热至沸或加5%盐酸，如发生混浊或有沉淀示含有水溶性蛋白质。3.3.1.5缩二脲试验：取检品的水溶液1ml，加10%氧化钠溶液2滴，充分摇匀，逐渐加入硫酸铜试液，随加摇匀，注意观察，如呈现紫色或紫红色示可能含有蛋白质和氨基酸。【注】凡蛋白质结构中含有两个或两个以上肽键（一CONH—）者均有此反应，能在碱性溶液中与Cu2+生成仙络合物，呈现一系列的颜色反应，二肽呈蓝色，三肽呈紫色，加肽以上呈红色，肽键越多颜色越红。3.3.1.6Millon反应：+Hg，H2NO2—红色（蛋白质分子中有酪氨酸组成）3.3.1.7Hopkins-Cole反应：+乙醛酸，浓硫酸一各色（蛋白质分子中有色氨酸组成）3.3.1.8色谱检识薄层检识一一吸附剂一一硅胶G展开剂——正丁醇：醋酸：水（4：1：5,上层）、氯仿：甲醇：17%氨水（2：2：1）、96%乙醇：26%氨水（77：23）、酚：水（3：1）。显色剂一一0.5%茚三酮/丙酮溶液，喷雾后于1100烘箱放置5分钟，显蓝紫允或紫色。吲哚醌试剂、1,2-萘醌-4-磺酸钠试剂（喷后室温干燥）3.3.1.8.2纸色谱检识展开剂——正丁醇：醋酸：乙醇：水（4：1：1：2）、甲醇：水：吡啶（20：20：4）、水饱和酚。3.3.2环肽的检识薄层检识：吸附剂——硅胶G或硅胶H展开剂一一氯仿：甲醇（9：1）显色剂0.2%茚三酮溶液3.3.3蛋白质的检识3.3.3.1加热沉淀试验：取供试液1ml,加热煮沸，如产生浑浊或沉淀，可能含有蛋白质。或直接加入5%硫酸铵溶液1ml，若产生沉淀，亦表明可能含有蛋白质。Biuret反应：取供试液1ml，加入40%氢氧化钠溶液2滴，摇匀，滴加1%硫酸铜溶液1-2滴，摇匀，如显蓝色，示含多肽或蛋白质。Solwaypurple反应：将供试液点在纸片上，滴加酸性蒽醍紫试剂，如呈紫色，示含有蛋白质，氨基酸、多肽皆不显色。3.3.3.4色谱检识吸附剂——硅胶g展开剂一一氯仿：甲醇或丙酮（9：1）显色剂0.2%茚三酮溶液3.4甾体化合物强心苷一一可溶于水、醇、丙酮等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯、含醇氯仿，几乎不溶于乙醚、苯、石油醚等极性小的溶剂。甾体皂苷一一一般可溶于水，易溶于热水、稀醇，难溶于丙酮，几乎不溶于或难溶于石油醚、苯、乙醇等亲脂性溶剂。甾体皂苷元则难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂。3.4.1甾体母核的颜色反应Lieberman—Burchard反应：将样品溶于氯仿或冰醋酸，加入醋酎-浓硫酸（20：1），产生黄-红-紫-蓝-绿-污绿等颜色变化，最后褪色。3.4.1.2氯仿-浓硫酸反应（Salkowski反应）：将样品溶于氯仿，加入浓硫酸，硫酸层显红或青色，氯仿层显绿色荧光。3.4.1.3Kahlenberg反应：将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20%五氯化锑或三氯化锑的氯仿溶液，干燥后，60-70°C加热，显蓝色、灰蓝色、灰紫色等多种颜色。Anastasia.HanOct.19tlj20083.4.1.4三氯醋酸反应（Rosen-Heimer反应）：将样品液滴加在滤纸上，喷25%的三氯乙酸乙醇溶液，加热60°C,呈红色至紫色。3.4.1.5冰醋酸-乙酰氯反应（Tschugaeff反应）：将样品溶解于冰醋酸中，加乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈红-蓝-绿等颜色。3.4.2强心昔3.4.2.1甾体母核检识（如上）C17位上不饱和内酯环的颜色反应（活性亚甲基）Legal反应（亚硝酰铁氰化钠反应）：取样品1-2mg，溶于毗啶2-3滴中，加3%亚硝酰铁氰化钠溶液和2mol/L氢氧化钠各1滴，反应液呈深红色并渐渐褪去。Raymond反应（间二硝基苯试剂反应）：取样品约1mg，以少量50%乙醇溶解后，加入间二硝基苯乙醇溶液0.1ml，摇匀后，再加入20%氢氧化钠0.2ml，呈紫红色。Kedde试剂（3,5-二硝基苯甲酸试剂反应）：取样品的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入3,5-二硝基苯甲酸试剂3-4滴，产生红色或紫红色。【注】①3,5-二硝基苯甲酸试剂一一A液：2%3,5-二硝基苯甲酸甲醇或乙醇溶液；B液：2mol/L的氢氧化钠溶液，用前等量混合。②此试剂用于强心昔纸色谱或薄层色谱显色剂，喷雾后呈紫红色，几分钟后褪色。3.4.2.2.4Baljet试剂（碱性苦味酸试剂反应）：取样品的甲醇或乙醇溶液于试管中，加入碱性苦味酸试液数滴，呈现橙或橙红色。【注】①碱性苦味酸试剂一一A液：1%苦味酸乙醇溶液；B液：5%的氢氧化钠水溶液，用前等量混合。②此反应比较慢，需放置15min以后才能显色。a-去氧糖颜色反应：Keller-Kiliani反应（K-K反应）：取样品1mg，用冰醋酸5ml溶解，加20%的三氯化铁水溶液1滴，混匀后倾斜试管，沿管壁缓慢加入浓硫酸5ml，观察界面和乙酸层的颜色变化。如有a-去氧糖，乙酸层显蓝色。界面的呈色，由于浓硫酸对昔元所起的作用逐渐向下层扩散，可显红色、黄色、绿色等，久置因炭化均转为暗色。3.4.2.3.2占吨氢醇反应：取样品少量，加占吨氢醇试剂1ml，置于水浴上加热3min，如有a-去氧糖即显红色。【注】①占吨氢醇试剂：占吨氢醇10mg溶于冰醋酸100ml中，加入浓硫酸1ml。②此反应极为灵敏，分子中的a-去氧糖可定量的发生反应，故可以用于定量分析。3.4.2.3.3对-二甲氨基苯甲醛反应：将样品的醇溶液点于滤纸上，喷对-二甲氨基苯甲醛试剂，于90C加热30s，分子中若有a-去氧糖，可显灰红色斑点。【注】对-二甲氨基苯甲醛试剂：1%对-二甲氨基苯甲醛的乙醇溶液4ml，加浓盐酸1ml。3.2.2.3.4过碘酸-对硝基苯胺反应：将样品的醇溶液点于滤纸或薄层板上，先喷过碘酸钠水溶液（过碘酸钠的饱和水溶液5ml，加蒸馏水10ml稀释），于室温放置10min，再喷对硝基苯胺试剂（1%对硝基苯胺的乙醇溶液4ml，加浓盐酸1ml混匀），则迅速在灰黄色背底上出现深黄色斑点，置紫外光下观察则为棕色背底上出现黄色荧光斑点。再喷以5%氢氧化钠甲醇溶液，则斑点转为绿色。3.4.2.4色谱检识3.4.2.4.1纸色谱检识：亲脂性较强的强心苷及苷元一一固定相：滤纸以甲酰胺或丙二醇浸渍数分钟移动相：苯或甲苯（以甲酰胺饱和）亲脂性较弱的强心苷及苷元一一固定相：同上移动相：二甲苯或丁酮的混合液，氯仿、苯和乙醇的混合液，氯仿：四氢吠喃：甲酰胺（50：50：6.5），丁酮：二甲苯：甲酰胺（50：50：4）等。亲水性较强的强心苷一一固定相：水浸渍透的滤纸移动相：水饱和丁酮或乙醇：甲苯：水（4：6：1），氯仿：甲醇：水（10：2：5，10：4：5，10：8：5）3.4.2.4.2薄层检识：吸附薄层一一吸附剂:硅胶展开剂：氯仿：甲醇：冰醋酸（85：13：2），二氯甲烷：甲醇：甲酰胺（80：19：1），乙酸乙酯：甲醇：水（8：5：5）等。分配薄层一一支持剂：硅藻土、纤维素固定相：甲酰胺、二甲基甲酰胺、乙二醇等展开剂：氯仿：丙酮（4：1），氯仿：正丁醇（19：1）等显色剂：2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/L氢氧化钾水溶液等体积混合，喷后强心苷显红色，几分钟后褪色。1%苦味酸水溶液与10%氢氧化钠水溶液（95：5）混合，喷后于90-100°C烘4-5min，强心苷呈橙红色。2%三氯化锑的氯仿溶液，喷后于100C烘5min，各种强心苷及其苷元显不同的颜色。3.4.3甾体皂昔3.4.3.1理化检识（详见三萜皂苷）3.4.3.2色谱检识吸附剂——硅胶展开剂一一亲水性一一分配色谱较好，中性溶剂系统；若吸附色谱，氯仿：甲醇：水（65：35：10）、正丁醇：醋酸：水4：1：5,上层）亲脂性皂苷或皂苷元一一苯：甲醇、氯仿：甲醇、氯仿：苯显色剂一一三氯乙酸、10%硫酸乙醇溶液、磷酸钥、五氯化锑等3.5糖和苷苷类一一其溶解性与苷元和糖的结构有关；苷元极性小，糖极性大。所以，苷类的极性随着糖基的数目增加而增大。苷类一般属于极性较大的化合物，一般溶于甲醇、乙醇、含水正丁醇等极性大的有机溶剂，一般也能溶于水。但是，一般极性小的大分子苷元（甾醇、萜醇等）形成的单糖苷可溶于低极性有机溶剂（氯仿等）。在不同机型溶剂顺次提取中药时，除了挥发油、石油醚部分等非极性部位外，在小、中、大极性部位均存在苷类的可能，但主要存在于极性大的部位。碳苷不溶于水或其他溶剂。3.5.1a-萘酚试验（Molish紫环反应）：取检品的水溶液1ml,加5%a-蔡酚乙醇试液1-3滴，振摇匀后，沿管壁滴入5-6滴浓硫酸，使成两液层，待2-3分钟后，两层液面出现紫红色环（糖、多糖或苷类）。【注】①多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与a蔡酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。②苷的分子结构中含有糖基，一般属于单糖类，如葡萄糖，鼠李糖、半乳糖，但也有含二分子糖（双糖）或多分子糖（多糖）。在上述反应条件下，苷被水解成单糖，因此苷蔡酚试验，系分子中糖部分的反应。③由于此反应较为灵敏，如有微量滤纸纤维或中草药粉末存在于溶液中，都能产生上述反应。故滤过时应加注意。3.5.2斐林试剂：+硫酸铜、酒石酸钾钠一一砖红色沉淀（还原糖）（―）+1%HCl+NaOH沉淀（苷元）△30min上清液（+）（多糖、苷）碱性酒石酸铜试液：取检品的水溶液1-2ml（如为醇溶液须将醇蒸发除去），加入碱性酒石酸铜试液1ml,于沸水浴上加热5分钟，产生棕红色或砖红色氧化亚铜沉淀，示有还原糖。【注】①如检液呈酸性，应先碱化。②此反应所产生的沉淀由于条件不同，其颜色也不同，质点上的呈黄色，质点大的呈红色。有保持性胶体存在时，也常产生黄色沉淀。③职样品中含有其他醛、酮及还原较强的其他成分，或中划药制剂中附加的抗氧剂、；葡萄糖等均可显阳性反应。3.5.3银镜反应：+0.1N硝酸银、5N氨水…银褐色（还原糖）3.5.4多糖的确证试验：取检品的水溶液5ml于水蒸发至干，加入1ml蒸馏水，再加入乙醇5ml，如出现沉淀，滤过收集后用少量热乙醇洗涤，再将沉淀物溶于3ml蒸馏水中，做下例试验：碘试验：取检品的不溶液1ml，加碘试液1滴，观察颜色变化，如呈蓝黑色为地衣糖；紫黑色为糊精；蓝色加热消失，冷后蓝色再现为淀粉。多糖水解：取检品的水溶液1ml，加入稀盐酸5滴，置沸水浴中加热10-15分钟，然后用10%氢氧化钠液中和至中性，再加新配制的碱性酒石酸铜试液4滴，另取检液1ml，不加酸水解直接加入上述试液4滴，两管同置水浴上煮沸5-6分钟。如果水解后生成棕红色，常常物的量比未经水解的多，则示有多糖。多糖水解后产生单糖，利用单糖的还原性，使铜离子还原成氧化亚铜。3.5.5色谱检识：薄层检识一一吸附剂：硅胶G、反相硅胶、纤维素展开剂一一硅胶一一正丁醇：乙酸：水（4：5：1，上层）、氯仿：甲醇：水65：35：10，下层）、乙酸乙酯：正丁醇：水（4：5：1，上层）等三元溶剂系统。极性小苷类一一也可用适当比例的氯仿：甲醇、丙酮：甲醇等二元溶剂系统。反相硅胶一一氯仿：甲醇、氯仿：甲醇：水、甲醇：水等。显色剂一一苯胺-邻苯二甲酸、三苯四氮盐试剂、间苯二酚-盐酸试剂、双甲酮-磷酸试剂等。纸色谱一一展开剂一一正丁醇：乙酸：水（4：5：1，上层）、正丁醇：乙酸：水（4：2：1，）、水饱和苯酚等。3.6黄酮类游离黄酮类化合物一一一般难溶于或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。一般不溶于石油醚中。黄酮苷类一一一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但溶于或不溶于苯、氯仿、乙醚等有机溶剂中。3.6.1检识母核3.6.1.1盐酸-镁粉反应：取检品的乙醇溶液1ml，加放少量镁粉（或锌粉），然后加浓盐酸4-5滴，置沸水浴中加热2-3分钟，如出现红色示有游离黄酮类或黄酮苷（以同法不加镁粉做一对照，如两管都显红色则有花色素存在。如继续加碳酸试液使成碱性即变成紫色双转变为蓝色，即证明含花色素）。【注】①此反应仅在化学结构中，第三位上带羟基的酮醇类显色较明显，而其它黄酮烷酮类均不甚明显。因此试验呈阴性反应是不能做出否定的结论，尚需结合其他实验再做结论。②试验应在醇中进行，水分多会影响颜色的生成。此反应较慢，有时需置水浴上加热，以促使反应的进行。③多数黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇显橙色一一紫红，黄酮苷及黄酮醇苷反应不明显，查耳酮、橙酮及儿茶素类无反应。3.6.1.2钠汞齐还原反应：在样品的乙醇溶液中加入钠汞齐，放置数分钟至数小时或加热，过滤，滤液用盐酸酸化，则黄酮、二氢黄酮、异黄酮、二氢异黄酮类显红色，黄酮醇类显黄缶淡红色，二氢黄酮醇显棕黄色。3.6.1.3四氢硼钠还原反应：取样品1-2mg溶于甲醇中，加四氢硼钠10mg，再滴加1%盐酸，二氢黄酮类或二氢黄酮醇类被还原产生红色-紫红色，其他黄酮醇类均为阴性反应。【注】①该反应是二氢黄酮醇类专属性较高的一种还原剂。②反应在试管中进行。③若A环与B环有一个以上羟基或甲氧基取代，则颜色加深。3.6.1.4三氯化铝反应：取检品的乙醇溶液点于滤纸片上（干后再点1次，使其浓度麻中），干后，喷雾1%三氯化铝乙醇试液，在紫外光灯下观察，呈现黄色、绿色、橙色等荧光为黄酮类；呈现天蓝色或黄绿色荧光，则为二氢黄酮类。这是区别二氢黄酮类化合物的一种鉴别反应。3.6.1.5碱性试剂显色反应：黄酮类可与碱性溶液生成黄色、橙色或红色等，且显色情况与化合物类型有关。【注】①黄酮类在冷和热的氢氧化钠水溶液中能产生黄-橙色；②查耳酮类或橙酮类在碱液中能很快产生红或紫红色；二氢黄酮类在冷碱中呈黄-橙色，放置一段时间或加热则呈深红-紫红色，此系二氢黄酮类在碱性条件下开环后变成查尔酮之故；③黄酮醇类在碱性条件下先呈黄色，当溶液中通入空气后，因3-羟基易氧化，溶液即转变成棕色；④当黄酮类化合物分子中有3个羟基相邻时，在稀氢氧化钠溶液中往往产生暗绿色或蓝绿色纤维状沉淀；⑤可以通过纸斑反应，在紫外光或可见光下观察颜色变化情况来鉴别黄酮类化合物；⑥氨气熏蒸呈现的颜色变化置空气中随即褪去，在经碳酸钠水溶液处理而呈现的颜色置空气中却不褪色。3.6.1.6浓氨水反应：取检品的乙醇溶液点于滤纸片上（干后，再点一次，使其溶液集中），干后，喷1%碳酸钠溶液或在氨蒸汽中熏几分钟，呈现亮黄、绿或橙黄色。如将氨气熏过的滤纸露置空气中，颜色逐渐褪去而变为原有的颜色（黄酮或其苷类）。3.6.1.7硼酸丙酮、枸橼酸丙酮试验：取检品的乙醇溶液1ml，在沸水浴上蒸干加入饱和硼酸丙酮溶液及10%枸橼酸丙酮溶液各0.5ml，蒸去丙酮后，在紫外光灯下观察，管内呈现强烈的绿色荧光（黄酮或其苷类）。3.6.1.8与五氯化锑反应：将样品5-10mg溶于无水四氯化碳5ml中，加2%五氯化锑的四氯化碳溶液1ml,查尔酮形成红或紫红色沉淀；而黄酮、二氢黄酮及黄酮醇类，显黄色至橙色。【注】在湿空气及含水溶液中颜色产物不稳定，反应溶剂必须无水。3.6.2取代基的检识一一与金属盐类试剂的络合反应，如黄酮类成分是有3-0H、"、或5—OH、c4=o或邻二酚羟基，则可与某些金属盐类试剂如铝盐（常用三氯化铝）、锆盐（二氯氧锆）、镁盐（醋酸镁）等反应生成有色络合物，可用于鉴别。3.6.2.1锆盐-枸橼酸反应：可以用来区别黄酮类化合物分子中3-OH或5—OH的存在。取样品0.5-1mg，用甲醇10ml溶解，加2%二氯氧锆（ZrOCl2）的甲醇溶液1ml到样品液中，若出现黄色，说明有3-OH或5-OH与锆盐生成络合物，再加入2%的枸橼酸的甲醇溶液，黄色不褪，示有3-OH，如果黄色减退，加水稀释后转为无色，示无3-OH，但有5-OH。【注】因为5-羟基、4-羰基与锆盐生成的络合物稳定性没有3-羟基、4-羰基锆络合物稳定，容易被弱酸分解。锆盐显色反应也可在滤纸上进行，得到的锆盐络合物斑点多呈黄绿色并有荧光。3.6.2.2氨性氯化锶反应：取样品少许于小试管中，加甲醇1ml溶解（必要时水浴加热）后，再加0.01mol/L氯化锶（SrCl2）的甲醇溶液3滴和被氨气饱和的甲醇溶液3滴，如产生绿色至棕色乃至黑色沉淀，表明有邻酚二羟基。【注】此反应不是所有黄酮类化合物的反应，而是具有邻二酚羟基黄酮的反应，也可以说某黄酮类化合物与氨性氯化锶反应为阳性，即生成绿至棕色乃至黑色沉淀，说明该化合物具有邻二酚羟基。在结构鉴定中有意义。其他：醋酸镁反应一一二氢黄酮、二氢黄酮醇可显天蓝色荧光，而其它黄酮则显其它色，故可用于鉴别。三氯化铝反应一一具有上述结构的黄酮与三氯化铝或硝酸铝生成的铭合物多为黄色或使原来黄色加深，并有黄或黄绿色荧光，可用于鉴别与定量分析。三氯化铁反应一一当黄酮含有氢键缔合的羟基时可呈明显的颜色反应，生成黄绿等色。因很多中药含黄酮类或鞣质等成分，所以不能用铁锅煎煮中药。3.6.3色谱检识：纸色谱一一展开剂一黄酮苷一一双向展开，第一相展开，采用醇性溶剂，如正丁醇：醋酸：水（4：1：5,上层，BAW系统）、叔丁醇：乙酸：水（3：1：1，TBA）、水饱和正丁醇等；第二相展开用水性溶剂，如氯仿：醋酸：水（3：6：1）、水、2-6%乙酸、3%氯化钠、乙酸：浓盐酸：水（30：3：10）等苷元——则多采用醇性溶剂、苯：乙酸：水（125：72：3）、氯仿：醋酸：水（13：6：1）、苯酚：水（4：1）花色苷及花色素一一可用含盐酸或醋酸的水溶液。显色剂一2%三氯化铝甲醇液（紫外光下检测）；血队/1%K3Fe（CN）6（1：1）混合液。薄层色谱一一吸附剂一一硅胶、聚酰胺、纤维素等展开剂一一硅胶薄层一一用于弱极性黄酮较好。常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）、苯：甲醇（95：5）、氯仿：甲醇（8.5：1.5，7：0.5）、苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）、苯：乙酸（45：4）、二氯甲烷：乙酸：水（2：1：1）12等。黄酮苷类常用正丁醇：乙酸：水（3：1：1）、甲酸：乙酸乙酯：水（9:1:1）等；分离二氢黄酮O-苷类常用氯仿：乙酸（100：4）等。聚酰胺一一适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类。乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。纤维素一一5%-40%乙酸、正丁醇：醋酸：水（4：1：5，上层，BAW系统）等。3.7生物碱生物碱类的溶解性与其分子中N原子的存在形式、极性基团的有无、数目以及溶剂等密切相关。亲脂性生物碱的溶解性一一这类生物碱的数目较多，绝大多数叔胺碱和仲胺碱。①游离生物碱一一易溶于乙醚、苯、卤代烷类等亲脂性有机溶剂，尤其在氯仿中的溶解度较大；可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯等有机溶剂；溶于酸水，难溶或不溶于水。②生物碱盐一一易溶于水，其无机盐在水中的溶解度大于有机酸盐；可溶于甲醇、乙醇；难溶或不溶于亲脂性有机溶剂。③少数生物碱盐的溶解性不符合一般规律。如奎宁、奎宁尼丁、辛可宁、吐根酚碱等生物碱的盐酸盐可溶于氯仿，麻黄碱草酸盐难溶于水。亲水性生物碱的溶解性一一水溶性生物碱数目较少，主要指季胺碱型生物碱，也包括一些分子量较小的叔胺碱或仲胺碱。①季胺型生物碱，这类生物碱易溶于水、酸水和碱水，可溶于甲醇、乙醇、正丁醇等极性大的有机溶剂，难溶或不溶于乙酸乙酯、乙醚、氯仿等低极性的有机溶剂。②小分子生物碱，少数分子量较小的叔胺或仲胺生物碱既可溶于水，也可溶于氯仿。这类生物碱包括麻黄碱、苦参碱、秋水仙碱等。具有特殊官能团的生物碱的溶解性一一①具有酚羟基（或羧基）的生物碱，两性生物碱，如吗啡、青藤碱等。除具有一般叔胺碱的溶解性能外，由于其结构中连有弱酸性官能团，也可溶于苛性碱溶液。②具内酯（或内酰胺）结构生物碱，这类生物碱如喜树碱、那可汀碱等在正常情况下，其溶解度类似一般叔胺碱。但在热水溶液中，其内酯（内酰胺）结构可开环形成羧酸盐而溶于水。3.7.1沉淀反应：试剂类型试剂名称组成反应特征碘-碘化钾试剂KI•I2红棕色沉淀碘化物复盐类碘化汞钾试剂EL类白色沉淀碘化铋钾试剂KBiI4黄至橘红色沉淀硅钨酸试剂SiO2•12WO3•nH2O淡黄或灰白色沉淀重金属盐类磷钼酸试剂H3PO4.12MO3・2H2O白色或黄褐色沉淀磷钨酸试剂H3PO4.12WO3・2H2O白色或黄褐色沉淀苦味酸试剂苦味酸黄色结晶大分子酸类苦酮酸试剂苦酮酸黄色结晶其它雷氏铵盐试剂NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]红色沉淀或结晶【注】沉淀反应的条件：反应环境一一生物碱沉淀反应一般在稀酸水溶液中进行。这是由于生物碱与酸成盐易溶于水，生物碱沉淀试剂也易溶于水，且在酸水中较稳定，而反应产物难溶于水，因而有利于反应的进行和反应的进行和反应结果的观察。净化处理一一生物碱的酸水提取液通常含有蛋白质、多肽、鞣质等成分，这些物质也能与生物碱沉淀试剂发生沉淀反应。为了避免其干扰，可将酸水也碱化后，用氯仿萃取，除去水溶性干扰成分，然后用酸水从氯仿中萃取出生物碱，以此酸水液进行沉淀反应。阳性结果的判断一一为了检识的准确性，一般选用三种以上的沉淀试剂进行反应，如果均有生物碱的沉淀反应，可判断为阳性结果。需要注意：①极少数生物碱不能与一般生物碱沉淀试剂产生反应。如麻黄碱、咖啡碱与多数生物碱沉淀试剂不能发生反应，因而只能用其它检识反应鉴别；②中药中有些非生物碱类物质也能与生物碱沉淀试剂产生沉淀反应，如蛋白质、多糖、氨基酸、鞣质等。因此制备共试品溶液时，需要净化处理除去这些物质，避免其干扰而导致错误的结论。沉淀反应的应用一一①检识反应；②指导生物碱的提取分离；③生物碱的分离纯化；④薄层或纸层色谱的显色剂。3.7.2显色反应：某些生物碱单体能与一些以无机酸为主的试剂反应生成具有颜色的产物，不同的生物碱产生不同的特征颜色，这种试剂称为生物碱的显色试剂。（1）生物碱显色试剂的种类:试剂名称试剂组成颜色特征Macquis试30%甲醛溶液0.2ml与10ml浓硫吗啡橙色至紫色；可待因显洋红色至黄棕色剂酸混合溶液Frohde试剂1%钼酸钠（铵）的浓硫酸溶液乌头碱显黄棕色、吗啡显紫色转棕色、黄连素显棕绿色、利血平显黄色转蓝色。Mandelin试1%帆酸铵的浓硫酸溶液苣菪碱、阿托品显红色、奎宁显淡橙色、吗啡显蓝紫色、可待剂因显蓝色、士的宁显蓝紫色显色反应的应用一一应用不广泛，但对检识和分析个别生物碱仍有一定的参考价值。①生物碱的检识；②生物碱的含量测定。3.7.3色谱检识吸附薄层一一吸附剂一一硅胶（稀碱湿法铺板）、碱性氧化铝（III级，干法铺板）【注】①硅胶作吸附剂，常用缓冲碱液代替水铺板（0.1%〜0.5mol\L）,克服拖尾。或在展开剂中加入二乙胺、氨水等。②二者均适合分离和检识脂溶性生物碱，氧化铝尤适合分离亲脂性较强的生物碱。展开剂一一亲脂性的混合溶剂。以氯仿为基本溶剂，根据色谱结果调整展开剂的极性。若Rf太小，适当加入甲醇、丙酮等极性大的溶剂；若Rf太大，适当加入苯、环己烷等极性小的溶剂。但往往展开剂中加入适量的碱性溶剂，如二乙胺、氨水等。分离季铵碱多用正丁醇-冰醋酸-水系统。显色剂一一常用改良碘化铋钾，显橘红色。分配薄层一一支持剂一一硅胶或纤维素粉固定相甲酰胺或水流动相脂溶性氯仿：苯（1：1）等；水溶性BAW系统。【注】配制流动相时，需用固定相饱和。纸色谱一一固定相一一水、甲酰胺、酸性缓冲液展开剂一一水一一BAW系统；甲酰胺或酸性缓冲溶液一一苯氯仿、乙酸乙酯等。3.8醍类化合物游离醌类一一极性较小，一般溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂，不溶或难溶于水；醌苷类一一极性显著增大，易溶于甲醇、乙醇中，溶于热水，但在冷水中溶解度较小，几乎不溶于乙醚、苯、氯仿等极性较小的有机溶剂中。蒽醌的碳苷在水中的溶解度较小，亦难溶于有机溶剂，但易溶于吡啶中。3.8.1显色反应3.8.1.1碱液试验（Borntragers反应）：取试液lml加1%NaOH溶液lml，即呈红-红紫色，亦有呈蓝色者，如再加酸，红色褪去，表示可能有羟基蒽醍。【注】羟基蒽醌类在碱性溶液中颜色加深，多呈红色或紫红色。此种红色物质不溶于有机溶剂，加酸则颜色褪去。3.8.1.2醋酸镁试验：取试液0.5ml，加人试剂2-3滴，若有羟基蒽醍类，则会出现橙、蓝、紫色等。颜色随羟基数目、位置而定。3.8.1.3硼酸试验：取试样提取液于滤纸上，干燥后喷洒2%硼酸水溶液，如呈黄橙、红色或有荧光，则表明有蒽醍或蒽醍苷。Feigl试验：取试样水或苯溶液1滴，加入25%碳酸钠水溶液、4%甲醛及5%邻二硝基苯的苯溶液各1滴，混合后置于水浴上加热，在1-4分钟内产生显著的紫色。（鉴定苯醍或和萘醍）3.8.1.5无色亚甲蓝显色反应一一苯醍、萘醍的专用显色剂，无色亚甲蓝显色剂的配制方法：将亚甲蓝100mg溶于乙醇100ml中，再加入冰醋酸1ml及锌粉1g，缓缓振摇至蓝色消失后备用。【注】此反应可在PC或TLC上进行，显蓝色。可与蒽醌类化合物相区别。试样在白色背景上与无色亚甲蓝乙醇（1mg/ml）溶液呈现蓝色斑点，蒽醌类化合物无此反应，可用于区别。3.8.1.6Kesting-Craven反应一一与活性亚甲基试剂（乙酸乙酰酯、丙二酸酯、丙二睛等）的反应，碱性条件下，样品液与活性亚甲基试剂的乙醇溶液反应，生成蓝绿色或蓝紫色。3.8.1.7对硝基二甲苯胺反应：0.1%对硝基二甲苯胺毗啶溶液反应，呈紫色、绿色（1，8-二羟基衍生物）、蓝色及灰色。【注】此反应是蒽酮类化合物的专属反应。不受蒽醌类、黄酮类、香豆素类、糖类及分类物质等化合物的影响。3.8.3色谱检识：薄层检识一一吸附剂一一硅胶G或聚酰胺，一般不使用氧化铝，因羟基蒽醌能与氧化铝形成螯合物，吸附性强，难以展开。展开剂一一多用混合溶剂。极性较弱的游离蒽醌一一可用亲脂性溶剂系统展开，如氯仿-醋酸乙酯（75:25），石油醚（30〜60°C）-醋酸乙酯-甲酸（15：5：1的上层）等。蒽醌苷类一一可采用极性较大的溶剂系统，如醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸（l00:17:13）等。显色剂一一蒽醌类及其苷在可见光下多显黄色，在紫外光下则显黄棕、红、橙色等荧光，可用氨熏、3%氢氧化钠或碳酸钠、10%氢氧化钾甲醇溶液喷雾，亦可0.5%喷醋酸镁甲醇溶液，喷后90C加热5min，观察颜色变化。纸色谱一一展开剂一一游离蒽醌一一一般在中性溶剂系统中进行，常用水或甲醇饱和的石油醚，如石油醚-丙酮-水（1:1：3上层）、97%甲醇饱和的石油醚；也可用酸性溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水（4：1：5上层）；非水溶剂系统，如以10%甲酰胺的乙醇液处理滤纸，石油醚-氯仿（94：6）为展开剂，羟基蒽醌苷元可获得较好的色谱效果。显色方法可参照薄层色谱法。蒽醌苷类一一极性较强，需要选用极性较大的溶剂系统，如正丁醇-醋酸乙酯-水（4：3：3上层），氯仿-甲醇-水（2：1：1下层）、苯：丙酮：水（4：1：2）。3.9苯丙素类化合物香豆素类一一游离的香豆素易溶于乙醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇，能溶于沸水，难溶于冷水；香豆素苷类易溶于甲醇和乙醇，可溶于水，而难溶于乙醚、氯仿等极性小的有机溶剂。木质素类一一游离木脂素多具亲脂性，易溶于苯、乙醚、氯仿、乙醇等有机溶剂，难溶于水，具酚羟基的木脂素可溶于碱水液中；木脂素苷水溶性增大。3.9.1香豆素类3.9.1.1显色反应1异羟肟酸铁反应：取1N盐酸羟胺甲醇液0.5m1，置于小试管中，加试液数滴，加2N氢氧化钾甲醇液使溶液呈碱性，在水浴上煮沸2分钟，冷却后滴加5%HCI