初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素亲和素放大技术

欢迎来主页下载欢迎来主页下载---精品文档精品文档精品文档第十一章生物素-亲和素放大技术是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。第一节生物素的理化性质与标记bioti244.31k一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。（一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。（四）探针。光敏生物素：用于DNA或RNADNABNHSBHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。（二）标记方法时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶。（三）标记注意事项（（性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。一、亲和素及其活性亲和素4，二者之间的亲和力极强。二、链霉亲和素及其活性链霉亲和素（SA）是由链霉菌streptomycesavidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素（SA）分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。三、亲和素（或链霉亲和素）的标记用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有1酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金。中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。几种制备亲和素（或链霉亲和素）与常用酶形成标记结合物的方法：（一）亲和素的标记1.HRP改良过碘酸钠法戊二醛法亲和素-生物素化HRP复合物的制备（二）链霉亲和素的标记链霉亲和素（SA）因表面所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素，因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用。HRP-SA-生物素化HRPAP-SA第三节生物素-亲和素系统的特点生物素、亲和素结合的多级放大作用，以及BAS既可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，使BASBAS一、灵敏度：每个亲和素分子有四个生物素结合部位，因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。二、特异性：亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。三、稳定性：性；而且酸、碱、变性剂等均不影响其结合。四、适用性：五、其他：BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等），适用于不同的反应体系；而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用。此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。第四节生物素-亲和素系统的应用一、生物素-亲和素系统基本类型及原理（一）。（二）直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。BAB法BAB是以游离的亲和素（或链霉亲和素）作为桥（如酶标生物素连接起来，达到检测反应分子的目的。ABC法ABC法是在BAB（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素（或链霉亲和素SABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）AB（或SAB）中未饱和的（或链霉亲和素或BA法或LAB）法是以标记亲和素（或链霉亲和素）检测。二、生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用（一）将BASELISA偶联可提高ELISA4记抗体，可减少反应中的空间位阻。（二）生物素-亲和素系统可作为均相酶免疫测定中高效的酶活性调变系统。三、生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用通常采用BA（或链霉亲和素（或链霉亲和素（BAB法（或链霉亲和素抗体的夹心法。酶放大时间分辨荧光免疫分析（EATRFIA）则是在抗原与固相McAb和生物素化McAb反应形成夹心复合物后，加入碱性磷酸酶（ALP）标记的SA（ALP-SA）继续反应，经生物素和SA的高亲和力结合，形成复合物：固相McAb-Ag-（McAb-生物素化）-（SA-ALP）ALP再作用底物生成产物5件下，可与Tb3-EDTA形成荧光寿命长且产额高的三元复合物用于检测。四、生物素-亲和素系统在放射免疫测定中的应用BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）。此外，BAS也可用于IRMA反应后B，F成分的分离。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的