蛋白质相互作用-课件

蛋白质相互作用生物与细胞所2010,9,28Proteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex蛋白质相互作用：本身具有生物学意义：这样的相互作用在生物体中是起什么作用的发展技术：利用这样的相互作用创造出一些人为的作用整体系统部分单体酵母蛋白质相互作用联络图人蛋白质相互作用联络图如此复杂的相互作用，哪些是有相关功能的？哪些是“噪音”？功能相关VS噪音1.生物信息学方法的优化与提高2.功能性实验研究手段的发展3.人员和资源从盲人摸象向研究大象的转变研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质相互作用的核心“种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了遗传这样一种本质现象可研究对象合适的研究方法不同的研究蛋白质相互作用的方法的差异群体的平均值：生化分析方法无数细胞的混合、所有蛋白质的混合2.代表性个体内的平均值：遗传分析方法、细胞分析方法从无数细胞中挑出少数细胞，单个细胞中的蛋白质混合3.单分子分析方法少数蛋白质的特性定量分析是研究蛋白质相互作用的基础Relativeexposurelevel稳定相互作用形成蛋白质复合体

（proteincomplex）瞬时相互作用（enzyme-substrate）生物学效应稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵。研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能确定研究目标寻找相互作用建立相互作用网络和功能体系从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。从生物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步研究相关蛋白质的相互作用。容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。发现蛋白质相互作用蛋白质-蛋白质直接相互作用遗传功能分析序列与结构比较模拟验证蛋白质相互作用不同方法的交叉验证不同生物体系中验证ProteininteractionAffinity:A+B=ABKd=[A][B]/[AB],Kd:dissociationconstantInteractionKdStreptavidin-biotinbinding10-14MAntibody-antigeninteraction(good)10-8-10-10MAntibody-antigeninteraction(weak)10-6MEnzyme-substrate10-6-10-10M蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Westernblot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2抗体筛库：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。已经被质谱和PCR所淘汰Westernblot1、电转移效率2、PVDF膜的充分浸润3、转移液中有太多的SDS4、膜的损坏5、转移时胶和膜没有完全接触6、抗体的问题7、抗体的浓度太高或太低8、还原性物质的存在9、封闭不充分免疫共沉淀免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2免疫共沉淀12354抗体很差，Westernblot问题Loading比例不对样品太多正确蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinityinteraction（亲和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白质组学技术）Affinityinteraction（亲和作用）GSTpulldown：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GSTtag。Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。各种不同的tag。许多GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelutionGSTpulldownGSTPulldownbindingwashelutionBiotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之一蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinityinteraction（亲和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白质组学技术）Yeasttwo-hybrid（酵母双杂交）

发现新的相互作用蛋白质

鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用

确定蛋白质间相互作用的功能基团lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ发现新的相互作用蛋白质BDB-PrMarker1AD基因库Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因库Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因库Marker2确定蛋白质间相互作用的功能基团ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白兰白白鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2兰：相互作用白：不相互作用Two-Hybrid的优点：是酵母细胞内的invivo相互作用。只需要cDNA，简单。弱的相互作用也能检测到。Two-Hybrid的缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。自身激活报告基因。对基因库的要求比较高，单向1/3是inframe蛋白质毒性。第三者Z插足介导的相互作用。假阳性。lacZUASDBXlacZDBXAutoactivationBDXMarker1ADYlacZUASADYlacZADYMarker2Phagedisplay（噬菌体展示）Phagedisplay（噬菌体展示）Phagedisplay的最大优点是数量大细胞：108~109细菌：1010Phage：1012寻找受体的配体7肽：8x1016蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinityinteraction（亲和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白质组学技术）SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions.SurfacePlasmonResonanceSPR优点：无标记、实时Label-freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions.Itfollowseverystepinamulti-stepanalysisprocedure,incontrasttolabel-basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep.RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly,asaplotofresponse(whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface)againsttime.Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis.Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun,forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction.蛋白质-蛋白质直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗体结合）Affinityinteraction（亲和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母双杂交和噬菌体展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白质组学技术）DonorAcceptor(2-10nm)

ExcitationfrequencyEmissionfrequency=Excitationfrequency

EmissionfrequencyFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)荧光共振能量转移为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。能量转移的效率：和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①供、受体的激发光要分得足够开；②供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠。Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength(380nanometers)ofthedonorAcceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum(510nanometers)ColordefiningGFPmutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLowWavelengthoftheFluorescentProteins

Measureinteractionsbetweentwoproteinsin vivoVerysensitiveExcellentresolutionHelpfulincharacterizingmajorconformational changesinmacromoleculesDeterminetheinteractionqualitativelyand quantitativelyAdvantagesofFRETLimitationsofFRETFRETonlyoccurswhenthetwofluorophoresarewithin2-10nmofeachother,whichmeansthatthefluorophoresmustbebroughttogetherviaverycloseprotein-proteininteractions.Requireexpensiveequipment.RequirelabelingofproteinsusingfluorophoreorGFPfusionProteomicanalysis（蛋白质组学技术）有专门的课题加以介绍研究蛋白质相互作用的单分子技术：原子力相互作用遗传功能分析利用功能缺陷和互补来分析不同蛋白质间的相互关系。不是蛋白质直接相互作用的证据，但可以提供进一步研究的目标。蛋白质遗传相互作用（geneticinteraction）是功能性相互作用有A：小量表达；有B：无表达；有C：无表达ABCABC有A和B：表达增加；有A和C：小量表达；有B和C：无表达ABCABC有A、B和C：高表达在A、B和C的蛋白质复合体中，A是和基因调控区结合并有小的转录活性；B可以和