免疫细胞的分离技术课件

免疫细胞的分离2021/6/81免疫细胞的分离2021/6/81免疫细胞1、概念

直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。2、分类

＊单核吞噬细胞系统：单核细胞/

巨噬细胞 树突状细胞（DCs)＊淋巴细胞系统：T淋巴细胞（Th/Tc) B淋巴细胞NK细胞

＊粒细胞系统:中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞2021/6/82免疫细胞1、概念2021/6/82免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离淋巴细胞的分离免疫细胞亚群的分离2021/6/83免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离2021/6/83细胞分离原理细胞的大小和比重细胞表面标志细胞黏附于各种物质表面的特性2021/6/84细胞分离原理细胞的大小和比重2021/6/84

一、人外周血单个核细胞的分离

——Ficoll分层离心法人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。

2021/6/85一、人外周血单个核细胞的分离

不同细胞密度不同

红细胞和多形核白细胞1.092

单个核细胞1.070

分层液1.077

2021/6/86不同细胞密度不同红细胞和多形核白细胞1.092

一、人外周血单个核细胞的分离

——Ficoll分层离心法

Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2021/6/87一、人外周血单个核细胞的分离

二、淋巴细胞的分离

尼龙棉柱法E花环分离法补体细胞毒法免疫荧光法

2021/6/88二、淋巴细胞的分离

尼龙棉柱法2021/6/88二、淋巴细胞的分离

——尼龙棉柱法原理：B细胞和单核细胞具有易黏附的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37℃作用1~2h后，洗脱的为非黏附性的T细胞。PBMC尼龙纤维棉柱B细胞单核细胞T细胞2021/6/89二、淋巴细胞的分离

二、淋巴细胞的分离

—E花环分离法（纯化T细胞）原理＊成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，CD2分子），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。

＊E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。

＊

E花环周围的绵羊RBC可用低渗法除去。2021/6/810二、淋巴细胞的分离

三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法流式细胞术2021/6/811三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法2021/6/811三、免疫细胞亚群的分离

—免疫磁珠分离法原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连，

在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。2022/12/2112免疫细胞的分离2021/6/812三、免疫细胞亚群的分离

三、免疫细胞亚群的分离

—免疫磁珠分离法1.直接法：

抗细胞表面分子抗体+磁性微球

免疫磁珠+细胞悬液

与免疫磁珠结合的细胞2.间接法：

第二抗体+磁性微粒

第一抗体+细胞

特定细胞2021/6/813三、免疫细胞亚群的分离

2021/6/8142021/6/8142021/6/8152021/6/815免疫磁珠法分选装置2021/6/816免疫磁珠法分选装置2021/6/816三、免疫细胞亚群的分离

—流式细胞术（FlowCytometry，FCM）FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。2021/6/817三、免疫细胞亚群的分离

—流式细胞术（流式细胞仪工作原理2021/6/818流式细胞仪工作原理2021/6/818流式细胞仪2021/6/819流式细胞仪2021/6/819免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离——Ficoll分层离心法淋巴细胞的分离——尼龙棉柱法、E花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法免疫细胞亚群的分离——免疫磁珠分离法、流式细胞术2021/6/820免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离——Ficoll分层离谢谢！2021/6/821谢谢！2021/6/821问题解答?问题解答?免疫细胞的分离2021/6/823免疫细胞的分离2021/6/81免疫细胞1、概念

直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。2、分类

＊单核吞噬细胞系统：单核细胞/

巨噬细胞 树突状细胞（DCs)＊淋巴细胞系统：T淋巴细胞（Th/Tc) B淋巴细胞NK细胞

＊粒细胞系统:中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞2021/6/824免疫细胞1、概念2021/6/82免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离淋巴细胞的分离免疫细胞亚群的分离2021/6/825免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离2021/6/83细胞分离原理细胞的大小和比重细胞表面标志细胞黏附于各种物质表面的特性2021/6/826细胞分离原理细胞的大小和比重2021/6/84

一、人外周血单个核细胞的分离

——Ficoll分层离心法人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。

2021/6/827一、人外周血单个核细胞的分离

不同细胞密度不同

红细胞和多形核白细胞1.092

单个核细胞1.070

分层液1.077

2021/6/828不同细胞密度不同红细胞和多形核白细胞1.092

一、人外周血单个核细胞的分离

——Ficoll分层离心法

Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2021/6/829一、人外周血单个核细胞的分离

二、淋巴细胞的分离

尼龙棉柱法E花环分离法补体细胞毒法免疫荧光法

2021/6/830二、淋巴细胞的分离

尼龙棉柱法2021/6/88二、淋巴细胞的分离

——尼龙棉柱法原理：B细胞和单核细胞具有易黏附的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37℃作用1~2h后，洗脱的为非黏附性的T细胞。PBMC尼龙纤维棉柱B细胞单核细胞T细胞2021/6/831二、淋巴细胞的分离

二、淋巴细胞的分离

—E花环分离法（纯化T细胞）原理＊成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，CD2分子），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。

＊E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。

＊

E花环周围的绵羊RBC可用低渗法除去。2021/6/832二、淋巴细胞的分离

三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法流式细胞术2021/6/833三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法2021/6/811三、免疫细胞亚群的分离

—免疫磁珠分离法原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连，

在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。2022/12/2134免疫细胞的分离2021/6/834三、免疫细胞亚群的分离

三、免疫细胞亚群的分离

—免疫磁珠分离法1.直接法：

抗细胞表面分子抗体+磁性微球

免疫磁珠+细胞悬液

与免疫磁珠结合的细胞2.间接法：

第二抗体+磁性微粒

第一抗体+细胞

特定细胞2021/6/835三、免疫细胞亚群的分离

2021/6/8362021/6/8142021/6/8372021/6/815免疫磁珠法分选装置2021/6/838免疫磁珠法分选装置2021/6/816三、免疫细胞亚群的分离

—流式细胞术（FlowCytometry，FCM）FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。2021/6/839三、免疫细胞亚群的分离

—流式细胞术（流式细胞