蛋白质总结课件

蛋白质总结第3章：氨基酸（重点）氨基酸分类

氨基酸的酸碱性质氨基酸的化学反应氨基酸混合物的分离知识点氨基酸：是蛋白质的构件分子，具有酸碱性质、手性、聚合能力、特定的侧链结构及多样的化学反应；兼性离子：指氨基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷的形式。在氨基酸晶体中或中性水溶液中以兼性离子形式存在；等电点：指氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的pH。等电点与离子浓度无关，只决定于等电兼性离子两侧的pKa值；氨基酸类别非蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸（20种）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸碱性氨基酸赖氨酸组氨酸精氨酸中性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰氨谷氨酰胺甘氨酸丙氨酸亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸色氨酸脯氨酸颉氨酸氨基酸的化学反应α-氨基参加的反应与亚硝酸反应（生成羟基氨基酸和氮气）与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护）烃基化反应DNFB反应（生成DNP-氨基酸）PITC反应（生成PTH-氨基酸）形成西佛碱反应（与醛类化合物）脱氨基反应α-羧基参加的反应成盐成酯成酰氯（与二氯亚砜等）脱羧基反应叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸）α-氨基与α-羧基共同参加反应与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质）成肽反应侧链R基参加的反应酪氨酸酚羟基组氨酸咪唑精氨酸胍基色氨酸吲哚基半胱氨酸巯基氨基酸的旋光性与光谱性质氨基酸的旋光性：

氨基酸的构型（指α-碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型，但D型氨基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的DL-消旋物氨基酸的光谱性质：

参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收；氨基酸混合物的分析分离分离方法柱层析纸层析（相对迁移率，非极性性质）薄层层析离子交换层析（电荷和非极性）气相层析高效液相层析氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！Ⅰ蛋白质概况蛋白质的化学组成：碳（50%）、氢（7%）、氧（23%）、氮（16%）、硫（0-3%）、其它元素微量；蛋白质的平均含氮量为16%，此为凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。

蛋白质是一类最重要的生物大分子，英文称protein，意为“最原初的，第一重要的”。分类Ⅰ单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、硬蛋白等）缀合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白、黄素蛋白等）分类Ⅱ：按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等；分类Ⅲ分类Ⅳ纤维状蛋白质（一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）单体蛋白质（寡）多聚蛋白质Ⅱ蛋白质的共价结构（一级结构）氨基酸残基、肽（键）、蛋白质一级结构的测定、氨基酸序列与生物功能、肽的人工合成知识点氨基酸残基：肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成因而不在是原来完整的分子，称为氨基酸残基；两个氨基酸形成一个肽键时失去一分子水，因此失去的水分子数比氨基酸残基数少一个。每个氨基酸残基的平均分子量为110。氨基酸的平均分子量为128。肽：由两个或多个氨基酸残基通过肽键相连而形成的化合物；肽有寡肽和多肽之分。一条肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称为N-末端，而另一端含有一个游离的末端羧基称为C-末端；蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N-末端和C-末端裂解多肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键的位置蛋白质测序的重要方法N-末端测定二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽，最后水解生成黄色DNP-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯异硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶法：外切酶，但效果不好C-末端测定肼解法：测定C-末端的最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶C羧肽酶Y二硫键的断裂过甲酸氧化法：将二硫键氧化成磺酸基巯基化合物还原法：将二硫键还原成巯基，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基，防止其重新被氧化氨基酸组成的测定：酸水解：是主要方法，多用HCl，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu；多肽链的裂解酶裂解：胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基端肽键嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基参与形成的肽键胃蛋白酶：在酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时，常用到此酶。化学裂解：溴化氰（CNBr）：只断裂Met的羧基形成的肽键羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一肽段的氨基酸测序Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解，一次可连续测出60-70个氨基酸残基的序列；工作量大，操作麻烦；现改用蛋白质测序仪。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱法：质谱仪由核苷酸序列推定法：mRNAcDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列肽段在肽链中次序的确定：需借助重叠肽。

重叠肽：由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同，产生的切口彼此错位，使两套肽段正好跨过切口而重叠的肽段；获得重叠肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品，得到两套或多套肽段。二硫键位置的确定：一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。蛋白质的氨基酸序列与生物功能；肽合成同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有共同的进化起源。同源蛋白质具有明显的氨基酸序列相似性，称之为序列同源。根据同源蛋白质的氨基酸序列资料可建立系统树（进化树）。两个物种的同源蛋白质，其序列中氨基酸的差异数目与这些物种间的进化发生差异是成比例的。蛋白质激活：在生物体内有些蛋白质是以前体形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽链后才具有生物活性，称之为蛋白质激活。如酶原激活。肽的人工合成：氨基酸共聚合（由一种或两种氨基酸反应）控制合成（由不同氨基酸按一定顺序）：接肽反应需接肽试剂，为避免接肽试剂与某些活泼基团反应，故在接肽前须首先将这些基团加以封闭或保护，如氨基保护或羧基保护等。在正常条件下，羧基和氨基之间不会自发形成肽键，即氨基或羧基需活化，通常是羧基活化。固相肽合成：是控制合成技术的巨大进步，利用固相肽合成仪已成功合成多种肽和蛋白质。其实质是肽的羧基端第一个氨基酸共价挂接在树脂上，然后加入氨基受保护的第二个氨基酸并发生缩合反应，形成肽键，依次类推。最后是肽与树脂断裂并去掉氨基端的保护基团。β折叠片：为重复性结构；β折叠片的肽链处于曲折的伸展状态；借助链间或肽段间的氢键而稳定；分为平行和反平行β折叠片，平行的比反平行的更规则。纤维状蛋白质：动物体的基本支架和外保护成分，分子具规则的线性结构。纤维状蛋白质角蛋白胶原蛋白：结缔组织中（骨、皮肤等）大量存在α角蛋白：主要存在于毛发中β角蛋白：天然存在于丝中说明：

α角蛋白经充分伸展后可转变成β角蛋白，即β折叠片结构。球状蛋白质：

其种类远比纤维状蛋白质多，蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要体现在球状蛋白质；球状蛋白质的整个肽链没有均一的二级结构，但具有多种二级结构元件如α螺旋、β折叠片、无规卷曲等，由此构建的三级结构—结构域，并将球状蛋白质分成4大类；其三维结构具有明显的折叠层次，且疏水测链球状分子内部，亲水侧链暴露在分子表面；在多数的胞内酶、血浆蛋白及蛋白类激素都属于球状蛋白质。超二级结构：由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多，有规则的二级结构串，并在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。已知有3种基本形式：αα、βαβ、ββ。结构域：在多肽链上由二级结构元件或超二级结构形成的相对独立的紧密球状实体，是三级结构的局部折叠区。较小的球状蛋白质或亚基是单结构域，而较大的球状蛋白质或亚基是多结构域。结构域可分4类：全α结构、α，β结构、全β结构和富含金属或二硫键结构域。Ⅳ蛋白质的结构与功能的关系肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质，它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性，它们的构象和功能也十分相似。肌红蛋白珠蛋白：含153个氨基酸残基，为1条肽链辅基血红素：原卟啉Ⅸ与Fe的络合物称血红素。卟啉化合物有很强的着色力，使生物组织呈现特定的颜色。卟啉环中心的铁原子有6个配位键，其中4个与四吡咯环的N原子相连，另2个沿垂直于卟啉环面的轴分布在环面的上下，这两个键合部位分别称为第5和第6配位。铁原子可以是亚铁（Fe2+）或高铁(Fe3+)，相应的血红素称为亚铁血红素和高铁血红素，相应的肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白和高铁肌红蛋白。类似的命名也用于血红蛋白。其中只有亚铁态的蛋白质才能结合O2。在肌红蛋白分子中，血红素共价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中。其中血红素铁在第5配位键与珠蛋白第93位His残基的咪唑N配位结合；第6配位键处于开放状态，是O2的结合部位。当第6位被O2分子所占据时，即为氧合肌红蛋白；血红素中Fe2+能进行可逆氧合作用。血红素的铁原子如果处在水环境则容易被氧化成Fe3+，失去氧合能力，此时H2O分子代替O2成为Fe3+的第6个配体。CO能与O2竞争第6配位键，且结合能力远大于O2。血红蛋白（Hb）的主要功能是在血液中结合并转运氧气，它存在于红细胞中。Hb的结构：脊椎动物的Hb由4个多肽链亚基组成，其中2个是一种亚基，2个是另一种亚基。如成人的血红蛋白主要是HbA，亚基组成为α2β2，次要组分是HbA2，亚基组成为α2δ2；每个血红蛋白分子都有4个血红素，每个血红素分别位于每个多肽链中的裂隙处，并暴露在分子的表面。氧合过程中的构象变化：氧合作用显著改变Hb的四级结构，且氧合血红蛋白和去氧血红蛋白具有不同的构象。氧合曲线和别构效应：氧合曲线呈S形曲线（氧饱和度与氧分压之间），即血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应，一个O2的结合增加同一Hb分子中其余空的氧合部位对O2的亲合力；Hb对O2亲和力的影响因素：H+、CO2促进O2从血红蛋白中释放，O2也促进H+、CO2在肺泡毛细血管中释放；BPG（2，3-二磷酸甘油酸）降低Hb对O2的亲和力，其只与去氧血红蛋白结合。血红蛋白分子病：导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生分子病，这是一种遗传病。了解最清楚的分子病是镰刀状细胞贫血病，该病人的不正常的血红蛋白称HbS，它只是在两条β链的N端第6位上Glu被Val置换。这一改变使血红蛋白表面产生一个疏水小区，导致血红蛋白聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低。地中海贫血是由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的。蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力。

蛋白质的酸碱性质：蛋白质是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，此外还有少数的末端α-羧基和α-氨基。可以把蛋白质分子看作是一个多价离子，所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液的pH所决定的。对某一种蛋白质来说，在某一pH时，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH称蛋白质的等电点。蛋白质的等电点在中性盐存在下可发生明显的变化，这是由于蛋白质分子中的可解离基团可与中性盐中的阳离子或阴离子相结合。在没有其他盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为蛋白质的等离子点。

蛋白质分子的形状：测定蛋白质分子的形状或构象，最精确的方法是X射线晶体结构分析，但这种方法只能测定晶体状态的蛋白质空间结构。对于溶液中的蛋白质分子的形状，只能借助间接的方法来描述蛋白质分子构象的轮廓。测定蛋白质分子相对质量的方法根据化学组成测定最低相对分子质量：测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量渗透压法：在半透膜存在时，蛋白质溶液将产生渗透压（平衡时的静水压力）。理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关，其关系可用范托夫公式表示：π=cRT/Mr，在高分子溶液中，π/c=RT/Mr+Kc，渗透压法简单、准确、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响，但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。沉降法：离心力作用沉降速率法：单位离心场的沉降速度是个定值，称沉降系数s。见P296页沉降平衡法：沉降产生浓度梯度凝胶过滤法：标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：加入SDS和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。蛋白质的胶体性质：蛋白质溶液属于胶体系统，其具备形成胶体系的条件：分散相（蛋白质分子颗粒）的质点大小在1~100nm，能在分散介质中作布朗运动；分散相的质点带同种电荷，不易凝聚成大颗粒而沉淀；分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层如水化层而不易凝聚。蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的，相对的。如果条件改变，则蛋白质就会从溶液中沉淀出来，如改变质点大小、电荷或水化层等。沉淀蛋白质的方法如下：盐析法：加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固蛋白质沉淀法

蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度，即设法除去变性的