版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
6分子生物学研究法(下)
--基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质和RNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5利用酵母鉴定靶基因功能6.6其它分子生物学技术16分子生物学研究法(下)
--基因功能研究技术6.1基6.1基因表达研究技术
6.1.3原位杂交技术(insituhybridization,ISH)原位杂交技术(insituhybridization,ISH):用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。菌落原位杂交26.1基因表达研究技术
6.1.3原位杂交技术(ins荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术它利用荧光标记的核酸片段为探针,与染色体或DNA上特异序列杂交,通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。FISH技术检测时间短,检测灵敏度高,无污染,已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。3荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsitu荧光原位杂交技术原理示意图4荧光原位杂交技术原理示意图4端粒DNA的荧光原位杂交5端粒DNA的荧光原位杂交56.1.4基因定点突变技术研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及结合配体能力的影响。主要蛋白质结构与功能的关系。重叠延伸技术和大引物诱变法。66.1.4基因定点突变技术研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、重叠延伸介导的定点诱变7重叠延伸介导的定点诱变7大引物诱变法8大引物诱变法86.3蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统:是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术,可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。96.3蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞。③该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。酵母单杂交的基本原理10酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(P从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。11从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因6.3.2酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)酵母双杂交系统:用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用,也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。完整的真核生物转录调控因子具有2个可分隔开的结构域:DNA特异结合域(DNA-bindingdomain,BD);转录激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有BD、AD,否则无法完成激活功能。126.3.2酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridBD-XAD-Y共同表达于酵母细胞内AD、BD会形成完整的转录激活因子,并激活相应的报告基因表达。如果2蛋白能发生相互作用13BD-XAD-Y共同表达于AD、BD会形成完整的转录如果2蛋酵母双杂交的基本原理示意图14酵母双杂交的基本原理示意图146.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(FRET)FRET荧光能量转移有三个基本条件:①给体与受体在合适的距离(1~10nm);②给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠;③给体与受体的偶极具有一定的空间取向。156.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(6.3.5RNAi技术及其应用RNAi(RNAinterference)技术:利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。166.3.5RNAi技术及其应用RNAi(RNAintersiRNA:小干扰RNAsmallinterferingRNA(siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),与mRNA的互补区发生碱基配对作用,阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称~。这种作用称RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。17siRNA:小干扰RNAsmallinterferingsiRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC),RISC进而识别和siRNA具有完全互补序列的mRNA,特异的降解mRNA。18siRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物(19196.6其它分子生物学技术
6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌体溶原周期、溶菌周期表面显示(surfacedisplay):是一种基因表达筛选技术。是将“诱饵”蛋白基因克隆在特定的表达载体中,使其以融合蛋白的形式显示在噬菌体表面,直接用于捕获靶蛋白库中可与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。206.6其它分子生物学技术
6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌重组噬菌体侵染宿主细菌后,复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒,直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。21重组噬菌体侵染宿主细菌后,复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌THEEND!22THEEND!226分子生物学研究法(下)
--基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质和RNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5利用酵母鉴定靶基因功能6.6其它分子生物学技术236分子生物学研究法(下)
--基因功能研究技术6.1基6.1基因表达研究技术
6.1.3原位杂交技术(insituhybridization,ISH)原位杂交技术(insituhybridization,ISH):用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。菌落原位杂交246.1基因表达研究技术
6.1.3原位杂交技术(ins荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术它利用荧光标记的核酸片段为探针,与染色体或DNA上特异序列杂交,通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。FISH技术检测时间短,检测灵敏度高,无污染,已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。25荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsitu荧光原位杂交技术原理示意图26荧光原位杂交技术原理示意图4端粒DNA的荧光原位杂交27端粒DNA的荧光原位杂交56.1.4基因定点突变技术研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及结合配体能力的影响。主要蛋白质结构与功能的关系。重叠延伸技术和大引物诱变法。286.1.4基因定点突变技术研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、重叠延伸介导的定点诱变29重叠延伸介导的定点诱变7大引物诱变法30大引物诱变法86.3蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统:是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术,可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。316.3蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞。③该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。酵母单杂交的基本原理32酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(P从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。33从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因6.3.2酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)酵母双杂交系统:用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用,也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。完整的真核生物转录调控因子具有2个可分隔开的结构域:DNA特异结合域(DNA-bindingdomain,BD);转录激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有BD、AD,否则无法完成激活功能。346.3.2酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridBD-XAD-Y共同表达于酵母细胞内AD、BD会形成完整的转录激活因子,并激活相应的报告基因表达。如果2蛋白能发生相互作用35BD-XAD-Y共同表达于AD、BD会形成完整的转录如果2蛋酵母双杂交的基本原理示意图36酵母双杂交的基本原理示意图146.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(FRET)FRET荧光能量转移有三个基本条件:①给体与受体在合适的距离(1~10nm);②给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠;③给体与受体的偶极具有一定的空间取向。376.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(6.3.5RNAi技术及其应用RNAi(RNAinterference)技术:利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。386.3.5RNAi技术及其应用RNAi(RNAintersiRNA:小干扰RNAsmallinterferingRNA(siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),与mRNA的互补区发生碱基配对作用,阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称~。这种作用称RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。39siRNA:小干扰RNAsmallinterferingsiRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC),RISC进而识别和siRNA具有完全互补序列的mRNA,特异的降解mRNA。40siRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物(41196.6其它分子生物学技术
6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌体溶原周期、溶菌周期
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 2024年核辐射产品行业企业战略发展规划及建议
- 2024年氟树脂市场分析及竞争策略报告
- 高考物理全程刷题训练周测八A卷市赛课公开课一等奖省名师获奖课件
- 高考生物总复习精彩三十三天二十八酶和ATP2全国公开课一等奖百校联赛示范课赛课特等奖课件
- 五年级英语下册-Unit-3Asking-the-way教案省公开课一等奖新名师获奖课件
- 湖北黄冈2023-2024学年中考语文全真模拟试题含解析
- 红河市重点中学2024年中考试题猜想物理试卷含解析
- 黑龙江省松北区达标名校2024届中考试题猜想化学试卷含解析
- 漫威电影英语展示省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件
- 高考物理复习机械振动与机械波光电磁波与相对论电磁波相对论简介随堂达标巩固落实资料省公开课一等奖百校联
- 电力工程冬季施工措施方案
- 部编版语文五年级下册《青山处处埋忠骨》观评课记录
- 环境监测持证上岗考核题库
- 铸铁材料特性及刀具应用金属加工材料培训资料
- J501-2钢筋溷凝土雨棚建筑构造
- 手机喇叭音腔设计要求
- 安全文明施工管理(EHS)方案(24页)
- 年处理量48万吨重整装置芳烃精馏的工艺设计——二甲苯塔
- 幼儿园绘本:《闪闪的红星》 红色故事
- 公司基建部岗位职责
- 乡村旅游项目商业计划书
评论
0/150
提交评论