基础与临床-课件

p53基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院张珊文2007年11月p53基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院1

P53基因结构：p53基因定位于人染色体17p13.1区位，全长16～20kb,有11个外显子和10个内含子，分子量为53KD的磷酸核蛋白，含393个氨基酸。功能：具转录因子的功能。野生型p53具细胞周期检查点功能，使受损细胞阻滞于G1期（或G2期）并引导细胞凋亡。突变型p53即丧失该功能，起癌基因作用。P53基因结构：p53基因定位于人染色体17p13.1区位2p53基因染色体定位p53基因染色体定位3p53基因结构p53基因结构4功能：基因组保护神功能：基因组保护神5第一部分研究

p53对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性的作用第一部分研究p53对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感6

国家自然科学基因课题（95规划）4种不同p53状况胃癌细胞4Gy剂量照射后，仅wtp53细胞出现了明显的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9％和61.1％)，和细胞凋亡(比例分别达13.0%和15.3%)。而其他3种p53异常的细胞都没有出现明显的G1期阻滞和凋亡效应。国家自然科学基因课题（95规划）74种胃癌细胞4Gy照射后w细胞、M细胞、neo细胞和823细胞生存率分别为0.1080.006、0.1550.004、0.1470.007和0.1400.013,W细胞生存率显著地低于后三种细胞（p<0.05）4种胃癌细胞肿瘤10Gy照射后体积抑制曲线：w细胞肿瘤放射反应曲线明显受到抑制4种胃癌细胞4Gy照射后w细胞、M细胞、neo细胞和823细8p53对人胃癌细胞热敏感性的作用4种不同p53状况胃癌细胞在42°C2h或43°C30min后8h，仅W细胞S期比例明显增加（P<0.05）分别占53.5％或50.0％，凋亡比率分别达10.5%和12.3%。而其他3种细胞的S期比例无明显增高，凋亡比例都为0(p<0.05)。p53对人胃癌细胞热敏感性的作用4种不同p53状况胃癌细胞在94种细胞种植肿瘤两次43°C20min加热后，w细胞肿瘤抑制曲线增长缓慢，到20天时仅增大了1倍，而其他3种细胞肿瘤增长迅速，到20天时增大了2.73.6倍,生长速度显著地高于W细胞（P<0.05）。4种细胞种植肿瘤两次43°C20min加热后，w细胞肿瘤10第二部分研究重组人p53腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性作用第二部分研究重组人p53腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感11作用机制Bax凋亡坏死作用机制Bax凋亡坏死12重组腺病毒颗粒激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫力免疫系统作用机制重组腺病毒颗粒激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体13转染率与病毒剂量病毒量为50MOI时，四种胃癌细胞感染率40%左右；100MOI时，感染率达80～90%（multiplicityofinfection,MOI,效靶比）。转染率与病毒剂量病毒量为50MOI时，四种胃癌细胞感染14Adp53表达定位1:100MOI效靶比Adp53产生细胞高转染率（100％）和p53基因在细胞内高表达，产生G2/M期阻滞和凋亡增加和细胞增殖抑制Adp53表达定位1:100MOI效靶比Adp53产生细胞高15图1100MOIAdp53感染4种胃癌细胞48小时后p53蛋白的免疫组化染色。Adp53感染细胞核着棕色。显示p53表达在细胞核内并达到100％转染。1.Marker2.W+Adp533.Wcontrol4.M+Adp535.Mcontrol6.neo+Adp537.neocontrol8.823+Adp539.823control图2：Westernblot印记法显示4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时，在53KD位置上均有一条清晰的杂交带，表明p53蛋白高表达。

Wt

MutNeoBGC-823图1100MOIAdp53感染4种胃癌细胞48小时后p516图3.4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时TUNEL法染色显示高比率凋亡细胞被染成棕色。图3.4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时T17表1Adp53结合4Gy照射胃癌细胞存活率

存活分数

细胞系Ad-p53组4Gy组p53+4Gy组

Wtp530.626±0.0190.117±0.0130.094±0.001

Mutp530.369±0.0240.169±0.0020.076±0.009Neo0.518±0.0160.152±0.004

0.110±0.005

8230.526±0.0230.150±0.005

0.108±0.025

注:采用HotellingT2检验表明Ad-p53+4Gy组存活分数显著低于4Gy组（P<0.001）Adp53结合放射实验表1Adp53结合4Gy照射胃癌细胞存活率18

表2Adp53结合4Gy照射对4种胃癌细胞的细胞周期和凋亡的影响（FCM法）细胞系条件G1SG2/MSub-G1凋亡率比值Wtp53对照组48.25.029.64.022.24.04.91.1Adp5343.612.031.810.524.616.510.61.64Gy61.013.97.513.42.0

Adp53＋4Gy41.512.021.76.5

36.815.5

39.95.0

3.0#Mutp53对照组48.512.039.55.512.010.05.52.0Adp5340.32.038.716.021.010.017.93.24Gy40.514.044.516.014.03.012.74.0

Adp53＋4Gy34.84.034.316.5

30.811.0

45.510.0

3.6Neo对照组44.05.033.36.522.75.07.02.5Adp5339.25.534.76.526.17.518.02.94Gy43.09.030.27.526.86.511.45.0

Adp53＋4Gy29.78.036.27.5

34.19.5

25.12.5

2.2823对照组52.03.034.85.513.24.05.13.0Adp5342.54.039.82.021.66.015.84.84Gy53.612.529.510.516.92.011.83.0

Adp53＋4Gy9.0

27.97.0

29.86.3

2.5表2Adp53结合4Gy照射对4种胃癌细胞的细胞周期19表3Adp53结合4Gy照射4种胃癌细胞的凋亡率(TUNEL法)

凋亡率（%）

细胞系对照组Ad-534Gyp53+4Gy凋亡率比值

Wt-p531.018.00.512.02.0

40.02.53.3*Mut-p530.028.02.03.01.0

48.03.5

16.0Neo0.026.03.05.50.5

36.00.56.5BGC8230.025.04.05.01.0

35.01.57.0

*凋亡率比值＝Adp53＋4Gy的凋亡率/单纯4Gy的凋亡率表3Adp53结合4Gy照射4种胃癌细胞的凋20W细胞肿瘤Adp53对6Gy照射的抑瘤率比值为1.41,而对M细胞肿瘤为1.91。

图5.2示Adp53结合6Gy照射对M细胞肿瘤的抑制作用

图5.1示Adp53结合6Gy照射对W细胞肿瘤的抑制作用相对体积W细胞肿瘤Adp53对6Gy照射的抑瘤率比值为1.41,而对21相对体积

表1Adp53结合加温对W细胞周期和凋亡的作用（FCM）条件G1SG2/MSub-G1热增效比对照7.322.0Adp5338.52.426.82.734.71.08.50.742C2h36.85.037.83.925.36.06.54.843C0.5h42.07.134.04.724.04.314.212.2Adp53+42C2h

6.7

34.02.9

21.49.8

3.3Adp53+43C0.5h7.6

23.87.1

22.512.2

1.6

表2Adp53结合加温对M细胞周期和凋亡的作用（FCM）

条件G1SG2/MSub-G1热增效比对照45.81.534.80.520.0Adp5341.32.442C2h41.35.036.512.222.043C0.5h43.83.938.54.712.2Adp53+42C2h42.510.832.03.3

25.3

2.1Adp53+43C0.5h41.52.536.39.9

22.512.513.30.5

1.8相对体积表1Adp53结合加温对W细22

时间（天）图6.1Adp53结合43C0.5hW细胞肿瘤抑制曲线

时间（天）图6.2Adp53结合43C0.5hW细胞肿瘤抑制曲线相对体积

W细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图6.1)：单纯43C0.5h加温、单纯Adp53和Adp53结合43C0.5h，肿瘤抑制率分别为15.8%、21.8%和27.2%,Adp53的热增效比为1.7。M细胞种植肿瘤相对生长曲线（见图6.2）：单纯加温、单纯Adp53和Adp53结合加温，肿瘤抑制率分别为24.2%、31.0%和37.8%，Adp53的热增效比为1.6。时23临床研究GeneTherapydream临床研究GeneTherapydream24p53基因－放疗

野生型p53促进放射线引发的细胞周期阻滞和凋亡。而变异p53减弱甚至取消这种效应腺病毒介导p53恢复肿瘤细胞内p53的功能，提高肿瘤细胞放射敏感性。p53基因－放疗野生型p53促进放射线引发的细胞周期阻滞25试验材料重组人p53腺病毒注射液（今又生）今又生结构：E1基因缺失的携带人野生型p53基因的5型腺病毒试验材料重组人p53腺病毒注射液（今又生）26基础与临床-课件27Adp53structure

GendicineisanE1substitutedreplication-incompetentrecombinantadenovirusencodingthehumanp53gene.E1A/E1Bdeletionp53StructuralproteinsE4E2E3Adp53structureGendicineisa28病毒表面的蛋白质与细胞表面的蛋白质通过“配子与配体”结合的方式，整个病毒颗粒被细胞吞噬入细胞内。在细胞浆内，病毒外壳与内核的DNA分离，其中外壳蛋白质被降解；DNA进入细胞核。在核内，DNA转录出RNA（mRNA),mRNA从胞核出来进入细胞浆；在胞浆翻译出p53蛋白质，p53蛋白质通过内质网系统再进入到细胞核与核内的DNA结合，以调节DNA（基因）表达。病毒表面的蛋白质与细胞表面的蛋白质通过“配子与配体”结合的方29P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生p53基因及其靶基因的表达治疗P53基因上调P21基因及Bax基因下调VEGF基因方法：IHC和RT－PCR及测序P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生p53基因及其靶基因的30免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达.张子苑NPC例，注药前p53－Adp53注射后p53+75%免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达.张子苑NPC例31刘凯恶性神经鞘瘤例注药前P53<+25%,PCR+何华树注药后P53＋25％何华树骨肉瘤例，注药前P53－,PCR±刘凯注药后P53>+75%,PCR++P53基因表达刘凯恶性神经鞘瘤例注药前P53<+25%,PCR+何华树32张沂择舌癌例，注药前P21－张沂择注药后P21＋50％丁先进NPC例，注药前P21—丁先进注药后P21＋25％P21基因表达张沂择舌癌例，注药前P21－张沂择注药后P21＋50％丁先进33丁先进NPC，注药前Bax－丁先进注药后Bax＋25～50％郑昌华NPC例，注药前Bax—郑昌华例注药后Bax＋50%张沂择例注药后Bax＋25-50％张沂择舌癌例注药前Bax－丁先进NPC，注药前Bax－丁先进注药后Bax＋25～50％34丁先进NPC例注药前VEGF＋75％丁先进例注药后VEGF－马冰清平滑肌肉瘤例注药前VEGF＋75%马冰清例注药后VEGF－张子苑例注药后VEGF＋25-50%张子苑NPC例注药前VEGF＋>75%丁先进NPC例注药前VEGF＋75％丁先进例注药后VEGF－35胃体癌，低分化腺癌（上图，疗前）VEGF－P53灌注热化疗后手术，胃角残存肿瘤，镜下仅见间质内散在稀少变性癌细胞VEGF＋胃体癌，低分化腺癌（上图，疗前）VEGF－P53灌注热化疗后36今又生特有p53序列331bp今又生特有p53序列331bp37马冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用药前>+75%,用药后>+75%PCR法示：用药前＋，用药后＋＋注药前仅38％吻合（如上图），注药后与p53专有序列比较100％吻合（如下图）马冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用药前>+75%,用药后>+38马冰清注药前与p53专有序列图比较仅38％吻合马冰清注药后与p53专有序列图比较达100％吻合马冰清注药前马冰清注药后与p53专有序列图比较达100％吻合39例2：(龚兆洪NPC,IHC示－)注今又生前样品p53与今又生专有p53序列仅有38％吻合0720290_G1_P53F_B06_0721708:DNAMAN2identity=38%5

GTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAAC

41GTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGG65TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATC101ACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTCTTC125ACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT

161CAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACA185GCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT221CATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGGCAC245CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAA

281CACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACAC例2：(龚兆洪NPC,IHC示－)注今又生前样品p53与40例1：注药后样品p53与今又生专有p53序列100％吻合（IHC示＋）0720299_G2~3_P53R_D09_0724712:DNAMAN1identity=100%1CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC38CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC61AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC

98AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC121TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT

158TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT181ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG218ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG241CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA

278CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA例1：注药后样品p53与今又生专有p53序列100％吻合（I41P53表达IHC法12/25(48%)

RT-PCR+测序法16/17(94.1%)P21表达IHC法11/25(44%)Bax表达IHC法9/24(37.5%)VEGF表达IHC11/24(45.7%)瘤内注射Adp53后P53及其靶基因表达情况P53表达IHC法12/25(48%)42重组人P53腺病毒制剂临床试验1998年2000年1月完成临床I期试验2001年10月～2003年5月完成II/III期临床试验北京肿瘤医院为牵头单位重组人P53腺病毒制剂临床试验1998年2000年1月完成临43李利华，鼻咽癌，右颈转移,T2N2M0右上颈转移淋巴结6.1cm2纤维鼻咽镜可见右鼻咽顶3cm肿物疗前CT示右鼻咽顶肿物5.5cm2病理：低分化鳞癌方法1李利华，鼻咽癌，右上颈转移淋巴结6.1cm2纤维鼻咽镜可见右44右上颈肿物B超探查右上颈肿物注射部位大小6.1cm2右上颈肿物，6.8cm2，注射今又生右上颈肿物B超探查右上颈肿物注射部位右上颈肿物，6.8cm45B超引导下，右上颈肿物穿刺注射今又生可见针尖位置在瘤内注药后即刻在瘤内形成一片强回声区B超引导下，右上颈肿物穿刺注射今又生可见针尖位置在瘤内注药后46方法2左：左侧鼻咽顶肿瘤右：直接瘤内注射今又生光纤鼻咽内镜引导下瘤内注射今又生左下图：60Gy，8次注今又生，鼻内镜见左鼻咽顶肿瘤消失方法2左：左侧鼻咽顶肿瘤右：直接瘤内注射今47各种给药途径各种给药途径48瘤内注射的意义1.避免免疫攻击2.腺病毒感染快而广3.高感染率致高疗效瘤内注射的意义1.避免免疫攻击49分组方案多中心随机对照II/III期临床试验基因－放疗组（GTRT）单纯放疗组（RT）分组方案多中心随机对照II/III期临床试验50方案

基因－放疗组（GTRT）每周5瘤内注射今又生1012VP/次，第三天放疗，病灶区采用与RT组相同照射,予70Gy/35f/7～8w,第五周(40Gy)，第八周(70Gy)，疗后2个月为疗效确认，以CT测量肿瘤体积，计算40Gy、70Gy、和确认时肿瘤缩小率（％）.按WHO实体肿瘤客观疗效评定标准，疗效评定为CR、PR、SD、PD。

方案基因－放疗组（GTRT）每周5瘤内注射今又生1012V51实验室特殊检查肿瘤组织p53蛋白检测（IHC法和测序法）病毒抗体检测（ELASA法）实验室特殊检查肿瘤组织p53蛋白检测（IHC法和测序法）52临床常规检验每周血、尿、便每月血生化（BUN,Cr,AST,ALT)每月心电图、胸片临床常规检验每周血、尿、便53毒性反应按WHO常见毒性分级标准评价毒付反应，按轻⑴、中⑵、重⑶、威胁生命⑷评价和记录。重点观察体温变化。一般在注射今又生后几小时内出现短暂的自限性发热（self-limitedfever），38C以上发烧者可酌情给予退烧药（消炎痛栓或柴胡注射液）。毒性反应按WHO常见毒性分级标准评价毒付反应，按轻⑴、中⑵、54统计学分析全部数据的统计分析，采用SPSS11.0统计软件，瘤灶缩小率比较采用t检验（两组方差不齐时，用t’检验），疗效比较采用Pearson卡方检验，不良反应测定值与基线比较采用Dunnett-t检验。统计学分析全部数据的统计分析，采用SPSS11.0统计软件55GTRTgroup(n=26)RTgroup(n=27)Gender(n)MaleFemaleAge(y)MedianRangeHistologictypeKeratinizingUndifferentiatedUICCstage(n)IIIIIIIV(M0)17948.512.419~7042208(30.8)8(30.8)10(38.4)19851.611.328~7132409(33.3)10(37.1)8(29.6)Table1.ComparisonofpatientcharacteristicsbetweenGTRTandRTgroups*Datapresentedasthenumberofpatients,withthepercentagesofthetotalinparentheses.GTRTgroup(n=26)RTgroup(n56表2鼻咽癌GTRT组26例和RT组27例瘤灶大小（mm2）比较组别瘤灶数肿瘤大小GTRT组26

676.15437.84mm2RT组44

645.91448.97mm2GTRT组瘤灶大于RT组，但成组t检验：Z=-0.271,p=0.787,两组瘤灶大小差别无统计学意义，说明两组疗效具有可比性。表2鼻咽癌GTRT组26例和RT组27例瘤灶大小（mm57GTRT组与GT组具可比性性别构成、年龄、病理、肿瘤大小、临床分期均无显著差别GTRT组与GT组具可比性性别构成、年龄、病理、肿瘤大小、临58鼻咽癌T2N2M0,III,疗前肿瘤23.5cm2充满鼻咽和鼻腔照射40Gy结合6次注射今又生后肿瘤完全消失鼻咽癌T2N2M0,III,照射40Gy结合6次注59Left

upperfig：NPCstageIV

pretreatmetNasopharyngealtumorNaso-endoscopephotoUpperfig:pretreatInferiorfig:at44Gyand5timesinjectiontumordisappeared.CTimagingat70GYandGendicine8times，nasopharynxtructurenormalLeftupperfig：NPCstageIV60Table3.Tumorshrinkagerates(%)ofGendicine-injectedtumorsofGTRTgroupascomparedwithRTgroup40Gy70GyValidationGTRT64.5017.78#84.3516.97#90.2721.15#RT41.5324.59#

56.6028.01#

72.5023.17#

RER*1.551.491.25#Tumorshrinkagerate(%)(XS)Radio-enhancementratio(RER)＝tumorshrinkagerateofGendicine-injectedtumorofGTRTgroup/tumorshrinkagerateoftumorofRTgroupP<0.01foreachtreatmentpointat40Gy,70Gyandvalidation.Table3.Tumorshrinkagerates61Table4.Responserate(%)ofGTRTgroupascomparedwithRTgroupgroup40Gy70GyValidationaFNCRPRSDPDFNCRPRSDPDFNCRPRSDPDGTRT26

2186026916102616910RT44

019250473251902881460aFN:tumorfocusnumber.P<0.001foreachtreatmentpointat40Gy,70Gyandvalidation.AtvalidationtheCRratewere16/26(61.5%)

forGTRT-tumorsand8/28(28.6%)

forRT-tumors,respectively.*Atvalidationtimepoint,theCRrateofGTRTgroupwas2.15timestothatofRTgroup(61.5%/28.6%)Table4.Responserate(%)of62今又生的坏死效应注射Adp53部位肿瘤B超显示肿瘤血供迅速减少甚至消失，CT显示肿瘤内CT值明显下降，坏死明显。有3例在40Gy时穿刺病理证实未见癌细胞（1-10侯凤才、1－14李文花、1－16邱礼斌）今又生的坏死效应注射Adp53部位肿瘤B超显示肿瘤血供迅速减63候凤才，鼻咽癌，左上颈淋巴结转移左外上后为注P53，5.7cm2，注射后弥散好；左内前下为对照，5.7cm240Gy,前LN，对照，2.9cm2,缩40％后LN1cm2，注P53,缩小72％，空洞坏死，针吸未见癌细胞第六次注射p53，LN，50Gy，活检病理：大部分坏死，残存少许纤维组织及横纹肌。候凤才，鼻咽癌，左上颈淋巴结转移左外上后为注P53，5.7c64AdverseEvents骨髓、肝、肾、肺、心功能今又生注射前后都保持在正常范围107病例theincidenceoffeverwas78.5%,

grade1(lessthan38C)fever43%

grade2(range38C~40C)35.5%.大多数发生自限性发烧（self-limitedfever)AdverseEvents骨髓、肝、肾、肺、心功能今又生65p53基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院张珊文2007年11月p53基因治疗的基础与临床研究北京大学临床肿瘤学院66

P53基因结构：p53基因定位于人染色体17p13.1区位，全长16～20kb,有11个外显子和10个内含子，分子量为53KD的磷酸核蛋白，含393个氨基酸。功能：具转录因子的功能。野生型p53具细胞周期检查点功能，使受损细胞阻滞于G1期（或G2期）并引导细胞凋亡。突变型p53即丧失该功能，起癌基因作用。P53基因结构：p53基因定位于人染色体17p13.1区位67p53基因染色体定位p53基因染色体定位68p53基因结构p53基因结构69功能：基因组保护神功能：基因组保护神70第一部分研究

p53对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性的作用第一部分研究p53对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感71

国家自然科学基因课题（95规划）4种不同p53状况胃癌细胞4Gy剂量照射后，仅wtp53细胞出现了明显的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9％和61.1％)，和细胞凋亡(比例分别达13.0%和15.3%)。而其他3种p53异常的细胞都没有出现明显的G1期阻滞和凋亡效应。国家自然科学基因课题（95规划）724种胃癌细胞4Gy照射后w细胞、M细胞、neo细胞和823细胞生存率分别为0.1080.006、0.1550.004、0.1470.007和0.1400.013,W细胞生存率显著地低于后三种细胞（p<0.05）4种胃癌细胞肿瘤10Gy照射后体积抑制曲线：w细胞肿瘤放射反应曲线明显受到抑制4种胃癌细胞4Gy照射后w细胞、M细胞、neo细胞和823细73p53对人胃癌细胞热敏感性的作用4种不同p53状况胃癌细胞在42°C2h或43°C30min后8h，仅W细胞S期比例明显增加（P<0.05）分别占53.5％或50.0％，凋亡比率分别达10.5%和12.3%。而其他3种细胞的S期比例无明显增高，凋亡比例都为0(p<0.05)。p53对人胃癌细胞热敏感性的作用4种不同p53状况胃癌细胞在744种细胞种植肿瘤两次43°C20min加热后，w细胞肿瘤抑制曲线增长缓慢，到20天时仅增大了1倍，而其他3种细胞肿瘤增长迅速，到20天时增大了2.73.6倍,生长速度显著地高于W细胞（P<0.05）。4种细胞种植肿瘤两次43°C20min加热后，w细胞肿瘤75第二部分研究重组人p53腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感性作用第二部分研究重组人p53腺病毒对人胃癌细胞放射敏感性和热敏感76作用机制Bax凋亡坏死作用机制Bax凋亡坏死77重组腺病毒颗粒激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫力免疫系统作用机制重组腺病毒颗粒激活免疫系统产生细胞因子和淋巴细胞提高抗肿瘤体78转染率与病毒剂量病毒量为50MOI时，四种胃癌细胞感染率40%左右；100MOI时，感染率达80～90%（multiplicityofinfection,MOI,效靶比）。转染率与病毒剂量病毒量为50MOI时，四种胃癌细胞感染79Adp53表达定位1:100MOI效靶比Adp53产生细胞高转染率（100％）和p53基因在细胞内高表达，产生G2/M期阻滞和凋亡增加和细胞增殖抑制Adp53表达定位1:100MOI效靶比Adp53产生细胞高80图1100MOIAdp53感染4种胃癌细胞48小时后p53蛋白的免疫组化染色。Adp53感染细胞核着棕色。显示p53表达在细胞核内并达到100％转染。1.Marker2.W+Adp533.Wcontrol4.M+Adp535.Mcontrol6.neo+Adp537.neocontrol8.823+Adp539.823control图2：Westernblot印记法显示4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时，在53KD位置上均有一条清晰的杂交带，表明p53蛋白高表达。

Wt

MutNeoBGC-823图1100MOIAdp53感染4种胃癌细胞48小时后p581图3.4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时TUNEL法染色显示高比率凋亡细胞被染成棕色。图3.4种胃癌细胞100MOIAdp53感染后48小时T82表1Adp53结合4Gy照射胃癌细胞存活率

存活分数

细胞系Ad-p53组4Gy组p53+4Gy组

Wtp530.626±0.0190.117±0.0130.094±0.001

Mutp530.369±0.0240.169±0.0020.076±0.009Neo0.518±0.0160.152±0.004

0.110±0.005

8230.526±0.0230.150±0.005

0.108±0.025

注:采用HotellingT2检验表明Ad-p53+4Gy组存活分数显著低于4Gy组（P<0.001）Adp53结合放射实验表1Adp53结合4Gy照射胃癌细胞存活率83

表2Adp53结合4Gy照射对4种胃癌细胞的细胞周期和凋亡的影响（FCM法）细胞系条件G1SG2/MSub-G1凋亡率比值Wtp53对照组48.25.029.64.022.24.04.91.1Adp5343.612.031.810.524.616.510.61.64Gy61.013.97.513.42.0

Adp53＋4Gy41.512.021.76.5

36.815.5

39.95.0

3.0#Mutp53对照组48.512.039.55.512.010.05.52.0Adp5340.32.038.716.021.010.017.93.24Gy40.514.044.516.014.03.012.74.0

Adp53＋4Gy34.84.034.316.5

30.811.0

45.510.0

3.6Neo对照组44.05.033.36.522.75.07.02.5Adp5339.25.534.76.526.17.518.02.94Gy43.09.030.27.526.86.511.45.0

Adp53＋4Gy29.78.036.27.5

34.19.5

25.12.5

2.2823对照组52.03.034.85.513.24.05.13.0Adp5342.54.039.82.021.66.015.84.84Gy53.612.529.510.516.92.011.83.0

Adp53＋4Gy9.0

27.97.0

29.86.3

2.5表2Adp53结合4Gy照射对4种胃癌细胞的细胞周期84表3Adp53结合4Gy照射4种胃癌细胞的凋亡率(TUNEL法)

凋亡率（%）

细胞系对照组Ad-534Gyp53+4Gy凋亡率比值

Wt-p531.018.00.512.02.0

40.02.53.3*Mut-p530.028.02.03.01.0

48.03.5

16.0Neo0.026.03.05.50.5

36.00.56.5BGC8230.025.04.05.01.0

35.01.57.0

*凋亡率比值＝Adp53＋4Gy的凋亡率/单纯4Gy的凋亡率表3Adp53结合4Gy照射4种胃癌细胞的凋85W细胞肿瘤Adp53对6Gy照射的抑瘤率比值为1.41,而对M细胞肿瘤为1.91。

图5.2示Adp53结合6Gy照射对M细胞肿瘤的抑制作用

图5.1示Adp53结合6Gy照射对W细胞肿瘤的抑制作用相对体积W细胞肿瘤Adp53对6Gy照射的抑瘤率比值为1.41,而对86相对体积

表1Adp53结合加温对W细胞周期和凋亡的作用（FCM）条件G1SG2/MSub-G1热增效比对照7.322.0Adp5338.52.426.82.734.71.08.50.742C2h36.85.037.83.925.36.06.54.843C0.5h42.07.134.04.724.04.314.212.2Adp53+42C2h

6.7

34.02.9

21.49.8

3.3Adp53+43C0.5h7.6

23.87.1

22.512.2

1.6

表2Adp53结合加温对M细胞周期和凋亡的作用（FCM）

条件G1SG2/MSub-G1热增效比对照45.81.534.80.520.0Adp5341.32.442C2h41.35.036.512.222.043C0.5h43.83.938.54.712.2Adp53+42C2h42.510.832.03.3

25.3

2.1Adp53+43C0.5h41.52.536.39.9

22.512.513.30.5

1.8相对体积表1Adp53结合加温对W细87

时间（天）图6.1Adp53结合43C0.5hW细胞肿瘤抑制曲线

时间（天）图6.2Adp53结合43C0.5hW细胞肿瘤抑制曲线相对体积

W细胞种植肿瘤相对生长曲线(见图6.1)：单纯43C0.5h加温、单纯Adp53和Adp53结合43C0.5h，肿瘤抑制率分别为15.8%、21.8%和27.2%,Adp53的热增效比为1.7。M细胞种植肿瘤相对生长曲线（见图6.2）：单纯加温、单纯Adp53和Adp53结合加温，肿瘤抑制率分别为24.2%、31.0%和37.8%，Adp53的热增效比为1.6。时88临床研究GeneTherapydream临床研究GeneTherapydream89p53基因－放疗

野生型p53促进放射线引发的细胞周期阻滞和凋亡。而变异p53减弱甚至取消这种效应腺病毒介导p53恢复肿瘤细胞内p53的功能，提高肿瘤细胞放射敏感性。p53基因－放疗野生型p53促进放射线引发的细胞周期阻滞90试验材料重组人p53腺病毒注射液（今又生）今又生结构：E1基因缺失的携带人野生型p53基因的5型腺病毒试验材料重组人p53腺病毒注射液（今又生）91基础与临床-课件92Adp53structure

GendicineisanE1substitutedreplication-incompetentrecombinantadenovirusencodingthehumanp53gene.E1A/E1Bdeletionp53StructuralproteinsE4E2E3Adp53structureGendicineisa93病毒表面的蛋白质与细胞表面的蛋白质通过“配子与配体”结合的方式，整个病毒颗粒被细胞吞噬入细胞内。在细胞浆内，病毒外壳与内核的DNA分离，其中外壳蛋白质被降解；DNA进入细胞核。在核内，DNA转录出RNA（mRNA),mRNA从胞核出来进入细胞浆；在胞浆翻译出p53蛋白质，p53蛋白质通过内质网系统再进入到细胞核与核内的DNA结合，以调节DNA（基因）表达。病毒表面的蛋白质与细胞表面的蛋白质通过“配子与配体”结合的方94P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生p53基因及其靶基因的表达治疗P53基因上调P21基因及Bax基因下调VEGF基因方法：IHC和RT－PCR及测序P53基因治疗的临床机理瘤内注射今又生p53基因及其靶基因的95免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达.张子苑NPC例，注药前p53－Adp53注射后p53+75%免疫组化法评价今又生瘤内注射后p53基因表达.张子苑NPC例96刘凯恶性神经鞘瘤例注药前P53<+25%,PCR+何华树注药后P53＋25％何华树骨肉瘤例，注药前P53－,PCR±刘凯注药后P53>+75%,PCR++P53基因表达刘凯恶性神经鞘瘤例注药前P53<+25%,PCR+何华树97张沂择舌癌例，注药前P21－张沂择注药后P21＋50％丁先进NPC例，注药前P21—丁先进注药后P21＋25％P21基因表达张沂择舌癌例，注药前P21－张沂择注药后P21＋50％丁先进98丁先进NPC，注药前Bax－丁先进注药后Bax＋25～50％郑昌华NPC例，注药前Bax—郑昌华例注药后Bax＋50%张沂择例注药后Bax＋25-50％张沂择舌癌例注药前Bax－丁先进NPC，注药前Bax－丁先进注药后Bax＋25～50％99丁先进NPC例注药前VEGF＋75％丁先进例注药后VEGF－马冰清平滑肌肉瘤例注药前VEGF＋75%马冰清例注药后VEGF－张子苑例注药后VEGF＋25-50%张子苑NPC例注药前VEGF＋>75%丁先进NPC例注药前VEGF＋75％丁先进例注药后VEGF－100胃体癌，低分化腺癌（上图，疗前）VEGF－P53灌注热化疗后手术，胃角残存肿瘤，镜下仅见间质内散在稀少变性癌细胞VEGF＋胃体癌，低分化腺癌（上图，疗前）VEGF－P53灌注热化疗后101今又生特有p53序列331bp今又生特有p53序列331bp102马冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用药前>+75%,用药后>+75%PCR法示：用药前＋，用药后＋＋注药前仅38％吻合（如上图），注药后与p53专有序列比较100％吻合（如下图）马冰清，平滑肌肉瘤，IHC法示：用药前>+75%,用药后>+103马冰清注药前与p53专有序列图比较仅38％吻合马冰清注药后与p53专有序列图比较达100％吻合马冰清注药前马冰清注药后与p53专有序列图比较达100％吻合104例2：(龚兆洪NPC,IHC示－)注今又生前样品p53与今又生专有p53序列仅有38％吻合0720290_G1_P53F_B06_0721708:DNAMAN2identity=38%5

GTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAAC

41GTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGG65TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATC101ACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTCTTC125ACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGT

161CAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACA185GCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCT221CATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGGCAC245CACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAA

281CACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACAC例2：(龚兆洪NPC,IHC示－)注今又生前样品p53与105例1：注药后样品p53与今又生专有p53序列100％吻合（IHC示＋）0720299_G2~3_P53R_D09_0724712:DNAMAN1identity=100%1CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC38CTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCC61AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC

98AGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTGGAGTC121TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT

158TTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTT181ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG218ACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCGGCTCATAGGG241CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA

278CACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAA例1：注药后样品p53与今又生专有p53序列100％吻合（I106P53表达IHC法12/25(48%)

RT-PCR+测序法16/17(94.1%)P21表达IHC法11/25(44%)Bax表达IHC法9/24(37.5%)VEGF表达IHC11/24(45.7%)瘤内注射Adp53后P53及其靶基因表达情况P53表达IHC法12/25(48%)107重组人P53腺病毒制剂临床试验1998年2000年1月完成临床I期试验2001年10月～2003年5月完成II/III期临床试验北京肿瘤医院为牵头单位重组人P53腺病毒制剂临床试验1998年2000年1月完成临108李利华，鼻咽癌，右颈转移,T2N2M0右上颈转移淋巴结6.1cm2纤维鼻咽镜可见右鼻咽顶3cm肿物疗前CT示右鼻咽顶肿物5.5cm2病理：低分化鳞癌方法1李利华，鼻咽癌，右上颈转移淋巴结6.1cm2纤维鼻咽镜可见右109右上颈肿物B超探查右上颈肿物注射部位大小6.1cm2右上颈肿物，6.8cm2，注射今又生右上颈肿物B超探查右上颈肿物注射部位右上颈肿物，6.8cm110B超引导下，右上颈肿物穿刺注射今又生可见针尖位置在瘤内注药后即刻在瘤内形成一片强回声区B超引导下，右上颈肿物穿刺注射今又生可见针尖位置在瘤内注药后111方法2左：左侧鼻咽顶肿瘤右：直接瘤内注射今又生光纤鼻咽内镜引导下瘤内注射今又生左下图：60Gy，8次注今又生，鼻内镜见左鼻咽顶肿瘤消失方法2左：左侧鼻咽顶肿瘤右：直接瘤内注射今112各种给药途径各种给药途径113瘤内注射的意义1.避免免疫攻击2.腺病毒感染快而广3.高感染率致高疗效瘤内注射的意义1.避免免疫攻击114分组方案多中心随机对照II/III期临床试验基因－放疗组（GTRT）单纯放疗组（RT）分组方案多中心随机对照II/III期临床试验115方案

基因－放疗组（GTRT）每周5瘤内注射今又生1012VP/次，第三天放疗，病灶区采用与RT组相同照射,予70Gy/35f/7～8w,第五周(40Gy)，第八周(70Gy)，疗后2个月为疗效确认，以CT测量肿瘤体积，计算40Gy、70Gy、和确认时肿瘤缩小率（％）.按WHO实体肿瘤客观疗效评定标准，疗效评定为CR、PR、SD、PD。

方案基因－放疗组（GTRT）每周5瘤内注射今又生1012V116实验室特殊检查肿瘤组织p53蛋白检测（IHC法和测序法）病毒抗体检测（ELASA法）实验室特殊检查肿瘤组织p53蛋白检测（IHC法和测序法）117临床常规检验每周血、尿、便每月血生化（BUN,Cr,AST,ALT)每月心电图、胸片临床常规检验每周血、尿、便118毒性反应按WHO常见毒性分级标准评价毒付反应，按轻⑴、中⑵、重⑶、威胁生命⑷评价和记录。重点观察体温变化。一般在注射今又生后几小时内出现短暂的自限性发热（self-limitedfever），38C以上发烧者可酌情给予退烧药（消炎痛栓或柴胡注射液）。毒性反应按WHO常见毒性分级标准评价毒付反应，按轻⑴、中⑵、119统计学分析全部数据的统计分析，采用SPSS11.0统计软件，瘤灶缩小率比较采用t检验（两组方差不齐时，用t’检验），疗效比较采用Pearson卡方检验，不良反应测定值与基线比较采用Dunnett-t检验。统计学分析全部数据的统计分析，采用SPSS11.0统计软件120