植物无病毒苗的培育

草莓土豆甘薯第章植物无病毒苗的培育（3学时）植物脱毒技术目的要求：1.掌握热处理和微茎尖培养脱毒的方法、无病毒植物的鉴定和利用；2.一般掌握其他途径脱毒方法；3.理解微茎尖脱毒的原理、无毒苗培养的重要意义；4.了解无病毒苗木的保存和利用方法。主要内容：1.微茎尖培养脱毒技术;2.脱毒苗的鉴定一、病毒在植物上的危害二、无病毒苗培育的意义三、植物脱毒机理及方法本节内容一、病毒在植物上的危害1.很严重2.目前无药可治3.生产损失大感染巴拿马病毒的香蕉相继枯死2007年，广州香蕉林近半感染病害面临绝迹危险。1.意义：采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。二、无病毒苗培育的意义2.培育途径：A.群体中未受病毒侵染的植株无性繁殖获得。B.种子繁殖获得（有些作物种子也含病毒）。但后代往往会发生变异。C.组培脱毒，既培育无病毒苗，相对保持物种遗传稳定性。又能减少污染，防止公害，保护环境。

当植物组织处于高于正常温度的环境（35-40℃）时，组织内部的病毒部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。三、植物脱毒机理及方法-热处理脱毒（温热疗法）热处理脱毒原理

适用于离体材料（如接穗）和休眠器官的处理。如：在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，使病毒失活。

三、脱毒机理及方法-热处理脱毒（温热疗法）热处理方法

（1）温汤（浸渍）处理：三、脱毒机理及方法-热处理脱毒（温热疗法）（2）热风（热空气）处理：热处理方法(1)恒温处理：将生长的盆栽植物移入温热疗室（光照培养箱）内，一般在35－40℃。对活跃生长的茎尖效果较好，处理时间因植物而异。

(2)变温处理：如马铃薯每天40℃处理4h，可清除芽眼中马铃薯的卷叶片病毒，而且保持芽眼的活力。

缺陷：不能脱除所有病毒。例如在马铃薯中只能消除卷叶病毒。

注：热处理需与其它方法配合应用三、脱毒机理及方法-热处理脱毒（温热疗法）（2）热风（热空气）处理：热处理方法Plantswereplacedinagrowthchamberundertheconditionsof16hoursphotoperiodat28ºCand8hoursdarkperiodat25ºC.Temperatureswereraised2ºC/2daystillfinalsettingof42ºCdayand39ºCnightwasobtained.Plantsweremaintainedundertheseconditionsforadditional4weeks.王乔春：利用茎尖培养和冷冻疗法消除甘薯体内具有协同作用的2种病毒超低温疗法：对茎尖进行超低温保存是脱除植物病毒的一种简单、快速而有效的方法，是植物脱毒的一种新途径。超低温处理茎尖脱毒这项世界尖端科研项目，被世界茎尖超低温冷冻脱除病原菌研究的奠基人之一的王乔春从芬兰赫尔辛基“平移”到了西北农林科大。“我们目前和国外的最前端研究处在同一水平线，植物脱毒研究保持领先。目前已开展了包括苹果、枣、葡萄、百合、马铃薯、甘薯等多项植物材料的超低温冷冻研究。”

王乔春

教育背景：

1978-1982年就读四川农业大学园艺系，毕业留校；1986-1988年留学丹麦皇家农业大学与瑞典农业大学获硕士学位；1994赴奥地利维也纳大学应用微生物系作访问学者；1995-1998年任四川农业大学林学园艺学院常务副院长，省农科院园艺所所长；1998-2003年留学以色列西伯莱大学获博士学位并开展博士后工作；

2003-2008年任芬兰赫尔辛基大学应用生物系访问教授。2008至今在西北农林科技大学园艺系工作。

(1).染病植株体内病毒的分布不均匀，越靠近茎顶的感染深度越低，生长点（约0.1－1.0mm）几乎不含或含病毒很少。原因可能是：a、分生组织中不存在无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，速度慢，不及细胞不断分裂和生长的速度。因此可利用微茎尖培养脱毒。三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒1.茎尖培养脱毒原理b、在旺盛分裂的细胞中，代谢活动很高，使病毒无法进行复制。c、在植物体内可能存在着病毒钝化系统，他在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。d、在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。茎尖培养主要用于消除病毒以及类病毒、类菌质体、细菌和真菌等病原菌。(1)、材料选择、消毒：在植株上直接取或在室内培养一段时间的植株上取顶芽或侧芽（3-5mm），然后消毒（或不消毒）。（2）、微茎尖的剥取：解剖镜下剥取。注意勿损伤生长点。三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒2.茎尖培养方法茎尖分生组织剥离三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒（3）、接种：随剥随接，尽快接种。（4）、培养：25℃左右，每天以16h、1500－5000lx光照下培养。保证较高温度和充足光照时间。（5）、继代、生根培养：同器官培养。三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒②茎尖培养方法（1）常用培养基：

MS

White、Morel（2）提高钾盐的含量会有利于茎尖生长。在用MS培养基时，其中有些离子的浓度过高应适当稀释。（3）严格控制糖浓度，一般2-4%，蔗糖、葡萄糖较好。（4）

适当提高生长素（0.1－0.5mg/L）与细胞分裂素浓度。有时可加活性炭。用NAA或IBA，Kt或BA，不用2,4－D。

GA适当。三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒3.培养基与培养方式注意：

一般用琼脂培养基。对于在固体培养基上易形成愈伤组织的须用滤纸桥。3培养基与培养方式三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒（1）.外植体大小：通常以带1-3个幼叶原基的茎尖（约0.3-0.5mm)作外植体为宜。不同植物脱毒适宜的茎尖大小不同。三、脱毒机理及方法-茎尖培养脱毒4.影响微茎尖培养的因素（2）.培养条件：增加光照（3）.外植体的生理状态

茎尖最好在活跃生长的芽上切取，取芽的时间最好是在萌动期较好。愈伤组织培养脱毒茎尖微体嫁接化学疗法脱毒珠心胚培养脱毒花药培养脱毒三、脱毒机理及方法-其它脱毒方式1、愈伤组织培养脱毒

原理：（1）愈伤组织分化植株，40%单细胞含有病毒，病毒的复制赶不上细胞的增殖速度（2）有些细胞经过突变获得了抗病毒性。

缺陷：

后代变异的几率大；有的愈伤组织不能分化成苗。

木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培养，再从成年无病树枝上切取微茎尖(0.3-1.0mm)，在砧木上进行微体嫁接，以获得无病毒植株。果树上应用多。2、茎尖微体嫁接题名：红花茎尖微嫁接技术研究作者：付宏岐

辛梅

宋金东

薛萍

史俊卿

出处：《人参研究》

2012年4期题名：梨的试管微嫁接技术研究

作者：赵巍巍

陈蕾

曹后男

宗成文

姜淑苓出处：《安徽农业科学》

CAS

2010年2期基金：国家自然科学基金项目(30560091,30960231）.题名：薄皮核桃微嫁接技术研究

作者：苗玉青

吴松林

赵惠新

李冠出处：《新疆农业为科学》

CAS

CSCD

2009年4期题名：三个枣品种的微嫁接快繁体系

作者：王娜

秦子禹

刘孟军

项殿芳出处：《河北科技师范学院学报》CAS

2009年2期

许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）处理植物，进行抑制病毒的增殖或使之不活化，整株植物用化学疗法不能除去病毒，但离体培养和原质体培养效果明显。3、化学疗法脱毒4、珠心胚培养脱毒柑橘类植物一般具有多胚现象，也就是说除了一个受精胚以外，还有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管系统无联系，因此由珠心胚产生的植株也就无病毒。但珠心胚大多不育，所以离体培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒起到重要的作用。如脱除柑橘的银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘退衰病等十分有效。申请专利号200710022803.7专利申请日2007.05.22名称一种利用草莓花药培养进行脱毒快繁的方法公开（公告）号CN101049090五病毒植物的鉴定

一、指示植物法

(一)指示植物的确定▼

(二）草本指示植物鉴定方法

▼（三）木本指示植物鉴定方法

▼▼利用病毒在其他植物上产生枯斑作为鉴别病毒种类的方法。专门用以产生局部病斑的寄主植物即为指示植物，又称寄主植物。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。应根据不同的病毒选择适合的指示植物。并且一年四季都可栽培。(一)指示植物的确定▲(二）草本指示植物鉴定方法

1.汁液涂沫法▼

2.小叶嫁接法▼(三）木本指示植物鉴定方法

嫁接鉴定法，常用劈接。▲①采取汁液在被鉴定植物上取1－3g幼叶，在研钵中加入10ml水及少量磷酸缓冲液（PH7.0），研碎后用双层纱布过滤，再在汁液中加入少量的500－600目金钢砂（摩擦剂）。②接种用棉球蘸取汁液在指示植物叶面上轻轻涂沬2－3次，后用清水冲洗叶面。③培养在防蚜虫温室内培养，15－25C，2－6天观察病症。1.汁液涂沫法▲小叶嫁接法二、抗血清鉴定法

植物病毒作为抗原，给动物注射后会在血清之中产生的抗体称抗血清。不同的病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类,是目前最有用的方法之一。

方法：

1、抗原的制备

2、抗血清的采收，分离

3、贮存-15℃至-25℃的冰冻条件下。

4、鉴定凝聚反应。四、酶联免疫鉴定法含义：采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。方法：将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，然后用特殊分光光度计测定。三、电子显微镜检查法六无病毒苗的保存和利用一、无病毒苗的保存繁殖1.通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目（网眼为0.4－0.5mm）的网纱，防止蚜虫进入。栽培用的土壤也