分子免疫学-之-抗体的制备及应用课件

分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活分子免疫学_之_抗体的制备及应用分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活抗体的制备及应用一、抗体的一些基本概念单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体(PolyclonalAntibody)多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

一、通过转变教育观念提升学生的批判性思维在传统的高中历史教育观念中，一直不能有效地突出学生的主体地位，都是讲究教师权威、教材的唯一性，这不利于培养和提升学生的批判性思维。高中历史教师必须要全面转变自己的教育观念，摒弃那种所谓历史教科书是最权威、最精确的知识；教师的知识就是比学生多；教师的讲话就是比学生重要；学生需要进一步教化等思想。其实任何的知识只不过是对客观世界的一种解释，这并不是永恒的，也不是最终的答案和终极真理，而会随着社会的发展和科学技术的不断进步被新的知识和新的理论所代替、所超越。由此可见，如果将教科书视作权威、视作真理，这是一种不正确的理念。以历史教科书为例，其编写者、审定者的指导思想以及世界观、价值观、个人知识、学术修养等诸多主观因素，都会制约着历史教材主流导向或者存在不同程度的片面性。但正是因为这个客观存在的现实为深入开展批判性学习拓展了一定的空间，同时也使培养和提升学生的批判性思维成为不可或缺的教学任务。长期以来，在学生眼里历史学科几乎就是等同于一门记忆和背诵的学科，这主要是因为传统的历史课堂教学一直都在让学生被动地接受历史知识，而从来不鼓励和引导学生主动积极地去探究历史知识，从而使历史教学只能成为一种记忆型教学，历史学科也成为一门记忆型学科。其实这是一个误解，同时也证明了在高中历史教学中提升学生批判性思维的重要性。这就要求教师在历史教学中不断转换教育理念，不仅要批判性地分析自己的思想与行为，还要引导学生批判性地分析自己，教师只有持有这样的观念进行教学，才能不断冲击学生思维的局限，从而逐渐培养和提升学生的批判性思维，这也是学生提升自己、超越自己的重要渠道。二、通过鼓励学生质疑问难提升学生的批判性思维在历史教学中要想提升学生的批判性思维，就要不断鼓励学生勇于质疑问难、敢问敢想，敢于对权威提出质疑，并能够有自己的思维。历史教师在教学中要通过鼓励和激发的手段，不断引导高中学生独立思考，通过组织学生对历史教材进行阅读、开展历史基础知识训练等手段，不断引导学生主动积极地去思考、去分析，从而有效诱导学生以批判性思维来看待问题、思考问题。教师在教学实践中，还要想方设法鼓励学生能够用不同的思维方式来思考，从而不断突破常规去探根究底，寻求多种解决问题的办法。在此过程中，学生的批判性思维就迸发了。教师应该对学生的不同看法和不同见解都要尊重，乐于听取学生不同的，哪怕是幼稚的意见。教师在教学中要多多引导那些有批判性思维潜质的的学生，从而确保那些学生能够起到以点带面的作用，通过他们与别人不同的批判性思维来激发其他学生的批判性意识。在教学实践中，教师要尽可能用热情的鼓励和比较恰当的评价，这样就可以激发学生不断地迸发更大的批判性意识，从而促进学生发挥出更大的聪明才智，不断另辟蹊径，大胆地去标新立异，大胆质疑问难，逐渐培养他们多方面、多角度思考问题，解决问题的习惯。教师在教学过程中，也可以引用以下事例：如果没有李四光对“中国贫油论”的怀疑就没有大庆油田的发现；如果爱因斯坦没有怀疑就不可能冲破牛顿的绝对时空观，从而提出相对论等。从而不断优化学生的批判性思维品质，真正将逻辑的理性与学生批判性激情有机结合起来。三、通过培育独立人格提升学生的批判性思维教育的本质就是对学生的人格进行教育，从而提升学生的全面素质。历史教育是教育的重要组成部分，所以，历史教育应该注重培养学生的健全人格。学生的独立人格就是指将学生作为个体有其自己独立自主的地位。所以，要培育学生的批判性思维就是要破除学生对教科书、学者和教师的迷信，让学生能够积极、主动的进行批判性思维。当然，批判性思维不是为了批判而批判，更不是为了挑战权威或个人出风头而批判，而是因为自己的经验和学识可以重新审视传统的观点是否有道理，是否能成立，是否有逻辑，从而能够去不断地去探寻真理，去发现真理，如此地批判性思维才有真正意义和真正价值。求真务实是历史教学的第一位要素。培育学生的批判性思维需要教师在教学中不断引导学生对事实进行冷静的逻辑分析和客观的细致推理。比如：在以往的中学历史教学中由于受传统观点的影响，一直都认为在古代中国的君主专制是落后的、封建的。学生如果缺乏批判性思维，就必然对这种在历史上存在过的政治体制少一种清醒的辨析，必然会导致学生对中国古代政治制度在认识上存在偏颇，从而使中国的古代政治文明长期在学生的印象中是黑暗的、专制的、封建的、落后的。如何辩证看待中国的古代文明，这就要求学生具备独立思考能力，也要具有独立的人格，这样才能为学生独立思考提供内驱力。教师在教学中，可以通过“开放型”作业，为学生的独立思考拓展空间，着眼于帮助学生形成独立的价值观、学术观，不断促使高中学生更加关注历史本来面目，从而在追求思想真理的道路上越走越远，真正完成从“自然的高中生”向“独立的高中生”的华丽过渡。[在传统的大学英语听力课堂上，由于受应试教育及英语四六级考试的影响，教师起主导作用，是课堂的管理者和知识的灌输者。课堂上教师经常使用的是“播放录音一核对答案一重放录音”这种教学模式。这种“三部曲”式的听力模式单调乏味，无形中把听力课堂转变为听力测试课，从而导致课堂气氛紧张、学生亦倍感压力。这种听力训练机械、被动，难以激发学生的兴趣和注意力，长此以往，学生将丧失英语学习的主动性和积极性。上述这种单向、线性的听力课堂模式弊端在于教师只重视听力练习，缺乏和学生间的双向互动及情感沟通，从而割裂了知识习得与情感交流间的内在联系，造成听力课堂上师生关系不和谐。为改变这种传统落后的听力教学观念，就要实施情感教学策略。情感教学是指在教学过程中，教师在认知因素的基础上，运用一定的教学手段，通过语言、态度、行为等情感因素来激发、调动有利于学生学习的积极情感因素，增强学生学习的动机、自信心、主动性和目的性，促进教学效果的积极化及教学效率的最大化，最终实现师生关系和谐发展，学生个性及素质的提高。情感作为学生精神生活的主宰，是学生学习的催化剂。尤其在英语听力课堂中，教师应合理调节和利用情感，努力调动学生的非智力因素。心理学研究表明，要想听懂某一听力材料，除了具备相应的专业知识，还须具备听的动机、自然放松的心境、较好的记忆力及意志力。如果学生处于焦虑、紧张的心态就会分散注意力，从而严重干扰听力理解，也就是语言输入的“情感过滤”问题。所以，从这点出发，军校英语教师要树立“以生为本”的素质教育理信念，激发学习动机、明确学习目的，强化学习兴趣，培养合作精神。军校学生是个特殊的群体，他们具有学生和军人双重身份。与同龄大学生相比，他们具有明显的三个特点：其一，接受正规化管理，具有严格的纪律要求，生活作息紧凑紧张；其二，生活空间相对固定，接触外界的时间和精力非常有限；其三，思维不够活跃，课堂气氛紧张而活泼不足。上述三个特点的形成与军校这个特定环境是密不可分的，首先，军校学生除了上课，课余时间还要参加体能训练、接受思想政治教育、学习条令条例，因此自由支配的时间非常有限。除此之外，军校更强调严格纪律的养成，学生接触的人和事非常单一，因此学生认知局限大、压力大，心理容易产生疲倦，易受外界干扰而产生焦虑或情绪波动。所以，根据军校学生生理、心理和认知特征，从英语学科的特点出发，笔者认为在英语听力课堂上应该从以下几方面实施情感教学。（一）加强英语听力策略训练，激发学生兴趣受应试教育影响，很多学生在高中阶段没有接受正规听力训练，所以在大学英语听力课堂上听懂的非常有限，于是就会产生紧张焦虑感。所以教师首先通过向学生阐释听力的特点、过程及方法，加强对学生的听力策略训练。任何活动的开展都以动机为前提，听力活动的有效进行同样依赖于学生动机的激发。学习动机能维持学生的学习活动，从来源上动机可以分为两类：内在动机和外在动机。内在动机直接与学习本身有关，由于学习活动本身能激发学生的浓厚兴趣，学习活动本身就是他们所追求的目的。外在动机是由外部力量和外部环境（即诱因）激发而来，与活动没有内在联系。在学校教育中，有多种多样的外部条件，可以吸引、激励学生，成为他们的动力源泉，如父母的鼓励、教师的表扬、竞争的奖励等等。（二）合理设计评价激励机制，激发学员参与性军校学生接受正规化管理，尤其重视教师对自己的评价。教师的评价直接影响学生的成就感及参与课堂积极性。所以，教师要采取多种评价、激励措施满足学生的需求。但在现行教育体制下，语言评价更多的是依靠单一的终结性评价，尤其是依靠试卷，这种评价方式不能全面地评价学生的进步，严重挫伤了学生学习语言的积极性，也对英语教学形成了负面影响。我国教育部制定的《大学英语课程教学要求》中明确提出教学评价分形成性评价和终结性评价两种：形成性评价是基于对学生学习全过程的持续观察、记录、反思做出的一种全新发展性评价方式，其目的是培养学生对自己进步过程的意识，使学生从被动接受评价转变成评价的主体和积极参与者。因此，在听力课堂中，教师不仅要重视终结性评价，更要重视学生在听力课堂上的表现，跟踪教学过程，如：学生主动发言、参与课堂小组活动等，更多地采取宽容、多元化的形成性评价方式，使学生逐渐养成主动获取知识和反我反思的学习习惯。（三）采取分组等合作方式，科学设置各种集体活动军校大学生由于受环境的制约，没有地方大学生的锻炼机会多，不利于听力能力的提高，所以教师更要在听力课堂上开展丰富多彩的活动促进对听力内容的理解及吸收。听力教学可以围绕语言目标，在学生对所听材料有一定理解的基础上、根据学生层次兴趣有效组织多种课堂活动，如：双人对话、小组讨论、分角色表演、复述听力内容等。另外，课堂听力活动可以结合网络、多媒体等现代化教学手段，增加活动的趣味性。这些活动一方面能鼓励学生参与其中，在真实的交际语境中达到培养语言交际能力的目的。在此过程中，学生也会把自身感情当作评估自己的标准，当感觉自己是群体中不可缺少的一员时，学生就会对自我价值产生认可。另一方面，学生能通过这些合作活动消除听力中的思想焦虑、促进合作意识，提高合作能力，体验集体荣誉感。而合作意识正是当代大学生必备的基本素质。当然，教师作为听力课堂活动的设计者，要充当好组织者、鼓励者和评价者的多重身份。（四）创设宽松、愉快、和谐的听力课堂气氛课堂不仅仅是教师教学、学生学习的地方交流，更是师生情感相互碰撞交融的地方。好的课堂气氛是一种隐性教育，指各种教学要素和关系达到一种动态的平衡与和谐，它对学生的自主性学习具有巨大的潜在影响，因为在这种氛围中，学生能轻松地获取知识，减轻自身学习焦虑感，并能激发学生学习英语的热情，变“厌学”为“愿学”。为了达到良好的互动交际，教师首先要保证课堂内外师生关系的平等，使学生在心理上觉得安全。鼓励学生大胆提出问题，唤起他们的成功欲望；要尽量给焦虑感强的学生提供感受学习成就感的机会，增强他们的自信心，帮助其形成良好的自我形象及对教师的依赖。对学生的语言输出错误要采取宽容的态度，并以委婉的态度引导他们自己发现并纠正错误，从而使不同层次水平的学生都能发挥自身的最大潜力。（五）教师要提高个人魅力及素养，调控教员自身的情绪状态教师除了要关注学员心理状态，在听力课堂上自身也要善于表达积极情感，用信任的目光、赞许的微笑、和蔼的语言，多给学生动口的机会，尽力做到对学生不指责、不呵斥、不急躁，多给予热情鼓励和引导，让他们在语言实践中主动发现问题、解决问题。从而表达出对学生的关心和爱护，消除师生之间的情感障碍，满足学生的情意需求。另一方面，在日常生活中要不断地与学生进行情感交流，以求进一步融洽师生感情。教师应把对学生的爱化为一个温柔的眼神、一个会意的微笑、一句暖心的话语、一个赞许的姿态、一个体贴入微的动作，公平公正地对待学生。对他们的点滴进步都给以鼓励，这样会使学生感觉到教师的关心、赏识和可敬，心理上就会产生一种说不出的愉悦与满足，激发他们的求知欲，鼓起他们英语听力的自信。这样，学生就会“亲其师而信其道”，更加热爱学习。总之，情感策略在大学英语听力实践中的积极作用是不容忽视的。军校大学英语教师应该关注学生在听力学习过程中的各种听力需求，通过有效的教学策略，培养他们的学习动机、学习兴趣。教师一定要结合实际情况，树立正确的人文教育观念，积极调动学生的人格因素，有效地利用现用的教学资源，努力帮助学生营造和谐、轻松、自然地学习氛围。分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活分子1抗体的制备及应用抗体的制备及应用2一、抗体的一些基本概念单克隆抗体

(MonoclonalAntibody,McAb)单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体

(PolyclonalAntibody)多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

一、抗体的一些基本概念单克隆抗体3抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇4Ag

单克隆抗体

B1B2B3B4B3B3B3B32

多克隆抗体341Ag单克51、单克隆抗体的特点特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！）因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。

抗体的性质相同，容易纯化、标记。1、单克隆抗体的特点特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不6脑垂体分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素hLH促黄体生成素hTSH促甲状腺激素hCG#绒毛膜促性腺激素βαβαα

β

βα脑垂体分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素βαβααβ7

单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反应）,或有相似的表位（不同程度的交叉反应）。单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有8产生凝集反应的原理113323221111112232322113产生凝集反应的原理1133232211111122323229购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验,使用浓度多少WB（Westernblotting，免疫印迹)IH(Immunohistochemistry,免疫组织化学)IC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫电镜)FCM(FlowCytometry,流式细胞仪)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验,使用浓度多少102、多克隆抗体的特点

多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。2、多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质11

比单抗更容易捕捉抗原。

因为含有抗不同表位的抗体，多种抗

体都可与抗原结合。

抗体的纯化、标记比单抗难因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多.比单抗更容易捕捉抗原。

因为含有抗不同表位的抗体，多12二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备无法采用生物化学的方法从多抗中分离必须采用细胞杂交的方法来制备能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问题也有机遇问题

二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备13制备单克隆抗体的基本原理：

致敏的B淋巴细胞骨髓瘤细胞（myeloma）

（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存）但能在体外长期生存）

阳性杂交瘤细胞(hybridoma)

（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养

（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体

1222212制备单克隆抗体的基本原理：1222212142、多抗的制备常用的免疫动物免疫的基本步骤如何免疫兔子2、多抗的制备151）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）1）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，16羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用。羊（sheep、goat）：常用于较大批量地172）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（ComplateFreund’adjuvand,含矿物油,卡介苗等).加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).2）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全18取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。(在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)取血测效价：193)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g）基础免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml）制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射加强免疫21免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)

免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价22单抗与多抗的区别

单抗多抗抗体组成单一复杂

抗体性质个体的属性群体综合的性质纯化标记容易，效果好难度高一些种属来源绝大多数是小鼠兔子、羊、豚鼠等制备周期长(最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少单抗与多抗的区别23什么情况需要制备单抗目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂什么情况需要制备单抗目的蛋白有结构类似物24三、抗体的纯化盐析法（硫酸铵沉淀)辛酸-硫酸铵沉淀法离子交换法亲和层析法凝胶过滤法三、抗体的纯化盐析法（硫酸铵沉淀)251、盐析法（硫酸铵沉淀)原理在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示(100%饱和度:767g/L)1、盐析法（硫酸铵沉淀)原理26主要步骤在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀；4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀；

可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度:50%饱和度:0.313g/ml45%饱和度:0.277g/ml40%饱和度:0.243g/ml最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析，测定浓度。主要步骤27特点成本低，步骤简单。抗体的回收率比较高。抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。需要高速离心机。特点282、正辛酸-硫酸铵沉淀法原理两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白.正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀.后加硫酸铵使抗体沉淀.2、正辛酸-硫酸铵沉淀法原理29主要步骤：调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分；。室温高速离心(10000g，30分钟),收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4℃高速离心(10000g，15分钟),弃上清；溶解沉淀，透析，测定浓度。主要步骤：30特点成本较低，步骤较复杂。抗体回收率很低。抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。特点313、离子交换法原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离.DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷.采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.

3、离子交换法原理32+++++--------

带负电荷的被吸附上带负电荷少的先被置换带负电荷多的后被置换+++++带负电荷带负电荷少带负电荷多33

NaClTris

梯度混合仪

连续梯度洗脱:NaClTris连续梯度洗脱:34

阶段洗脱:T离子强度蛋白浓度T倒入一定浓度的NaCl溶液通过离心来分离阶段洗脱:T离子强度蛋白浓度T倒入一定浓度的Na35主要步骤

先用硫酸铵沉淀抗体，粗提；将样品过柱；洗去没有结合的物质；用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液；紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。主要步骤36特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。特点374、亲和层析法原理利用蛋白质之间的特异性结合（抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法4、亲和层析法原理38使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)39主要步骤

将ProteinA与活化的柱子相结合(买商品柱)；将腹水或血清处理后过柱；用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零；用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液；测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。主要步骤40葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA,SPA)金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白分子量42000,等电点pH5.1可与大多数动物Ig的Fc段结合一个SPA分子有4个相似的活性部位与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差

葡萄球菌A蛋白41特点成本高，步骤较简单。抗体回收率低。抗体纯度高，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要自动收集器。特点425、凝胶过滤法(分子筛)原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离.大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。适合于IgM类抗体的纯化

(五聚体,分子量约800KD)5、凝胶过滤法(分子筛)原理43分子免疫学_之_抗体的制备及应用课件44主要步骤将腹水或血清处理后上柱,样品要浓；(可用G-200，柱子要长，80-100cm)待样品入柱后,用缓冲液过柱；等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。收集第一峰。主要步骤45特点成本高，步骤较简单。抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。抗体纯度较高。需要自动收集器。特点4641、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹

42、只有在人群中间，才能认识自己。——德国

43、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所说的话，则需要头脑。——玛丽·佩蒂博恩·普尔

44、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。——贝多芬

45、自己的饭量自己知道。——苏联41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜47分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活分子免疫学_之_抗体的制备及应用分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活抗体的制备及应用一、抗体的一些基本概念单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体(PolyclonalAntibody)多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

一、通过转变教育观念提升学生的批判性思维在传统的高中历史教育观念中，一直不能有效地突出学生的主体地位，都是讲究教师权威、教材的唯一性，这不利于培养和提升学生的批判性思维。高中历史教师必须要全面转变自己的教育观念，摒弃那种所谓历史教科书是最权威、最精确的知识；教师的知识就是比学生多；教师的讲话就是比学生重要；学生需要进一步教化等思想。其实任何的知识只不过是对客观世界的一种解释，这并不是永恒的，也不是最终的答案和终极真理，而会随着社会的发展和科学技术的不断进步被新的知识和新的理论所代替、所超越。由此可见，如果将教科书视作权威、视作真理，这是一种不正确的理念。以历史教科书为例，其编写者、审定者的指导思想以及世界观、价值观、个人知识、学术修养等诸多主观因素，都会制约着历史教材主流导向或者存在不同程度的片面性。但正是因为这个客观存在的现实为深入开展批判性学习拓展了一定的空间，同时也使培养和提升学生的批判性思维成为不可或缺的教学任务。长期以来，在学生眼里历史学科几乎就是等同于一门记忆和背诵的学科，这主要是因为传统的历史课堂教学一直都在让学生被动地接受历史知识，而从来不鼓励和引导学生主动积极地去探究历史知识，从而使历史教学只能成为一种记忆型教学，历史学科也成为一门记忆型学科。其实这是一个误解，同时也证明了在高中历史教学中提升学生批判性思维的重要性。这就要求教师在历史教学中不断转换教育理念，不仅要批判性地分析自己的思想与行为，还要引导学生批判性地分析自己，教师只有持有这样的观念进行教学，才能不断冲击学生思维的局限，从而逐渐培养和提升学生的批判性思维，这也是学生提升自己、超越自己的重要渠道。二、通过鼓励学生质疑问难提升学生的批判性思维在历史教学中要想提升学生的批判性思维，就要不断鼓励学生勇于质疑问难、敢问敢想，敢于对权威提出质疑，并能够有自己的思维。历史教师在教学中要通过鼓励和激发的手段，不断引导高中学生独立思考，通过组织学生对历史教材进行阅读、开展历史基础知识训练等手段，不断引导学生主动积极地去思考、去分析，从而有效诱导学生以批判性思维来看待问题、思考问题。教师在教学实践中，还要想方设法鼓励学生能够用不同的思维方式来思考，从而不断突破常规去探根究底，寻求多种解决问题的办法。在此过程中，学生的批判性思维就迸发了。教师应该对学生的不同看法和不同见解都要尊重，乐于听取学生不同的，哪怕是幼稚的意见。教师在教学中要多多引导那些有批判性思维潜质的的学生，从而确保那些学生能够起到以点带面的作用，通过他们与别人不同的批判性思维来激发其他学生的批判性意识。在教学实践中，教师要尽可能用热情的鼓励和比较恰当的评价，这样就可以激发学生不断地迸发更大的批判性意识，从而促进学生发挥出更大的聪明才智，不断另辟蹊径，大胆地去标新立异，大胆质疑问难，逐渐培养他们多方面、多角度思考问题，解决问题的习惯。教师在教学过程中，也可以引用以下事例：如果没有李四光对“中国贫油论”的怀疑就没有大庆油田的发现；如果爱因斯坦没有怀疑就不可能冲破牛顿的绝对时空观，从而提出相对论等。从而不断优化学生的批判性思维品质，真正将逻辑的理性与学生批判性激情有机结合起来。三、通过培育独立人格提升学生的批判性思维教育的本质就是对学生的人格进行教育，从而提升学生的全面素质。历史教育是教育的重要组成部分，所以，历史教育应该注重培养学生的健全人格。学生的独立人格就是指将学生作为个体有其自己独立自主的地位。所以，要培育学生的批判性思维就是要破除学生对教科书、学者和教师的迷信，让学生能够积极、主动的进行批判性思维。当然，批判性思维不是为了批判而批判，更不是为了挑战权威或个人出风头而批判，而是因为自己的经验和学识可以重新审视传统的观点是否有道理，是否能成立，是否有逻辑，从而能够去不断地去探寻真理，去发现真理，如此地批判性思维才有真正意义和真正价值。求真务实是历史教学的第一位要素。培育学生的批判性思维需要教师在教学中不断引导学生对事实进行冷静的逻辑分析和客观的细致推理。比如：在以往的中学历史教学中由于受传统观点的影响，一直都认为在古代中国的君主专制是落后的、封建的。学生如果缺乏批判性思维，就必然对这种在历史上存在过的政治体制少一种清醒的辨析，必然会导致学生对中国古代政治制度在认识上存在偏颇，从而使中国的古代政治文明长期在学生的印象中是黑暗的、专制的、封建的、落后的。如何辩证看待中国的古代文明，这就要求学生具备独立思考能力，也要具有独立的人格，这样才能为学生独立思考提供内驱力。教师在教学中，可以通过“开放型”作业，为学生的独立思考拓展空间，着眼于帮助学生形成独立的价值观、学术观，不断促使高中学生更加关注历史本来面目，从而在追求思想真理的道路上越走越远，真正完成从“自然的高中生”向“独立的高中生”的华丽过渡。[在传统的大学英语听力课堂上，由于受应试教育及英语四六级考试的影响，教师起主导作用，是课堂的管理者和知识的灌输者。课堂上教师经常使用的是“播放录音一核对答案一重放录音”这种教学模式。这种“三部曲”式的听力模式单调乏味，无形中把听力课堂转变为听力测试课，从而导致课堂气氛紧张、学生亦倍感压力。这种听力训练机械、被动，难以激发学生的兴趣和注意力，长此以往，学生将丧失英语学习的主动性和积极性。上述这种单向、线性的听力课堂模式弊端在于教师只重视听力练习，缺乏和学生间的双向互动及情感沟通，从而割裂了知识习得与情感交流间的内在联系，造成听力课堂上师生关系不和谐。为改变这种传统落后的听力教学观念，就要实施情感教学策略。情感教学是指在教学过程中，教师在认知因素的基础上，运用一定的教学手段，通过语言、态度、行为等情感因素来激发、调动有利于学生学习的积极情感因素，增强学生学习的动机、自信心、主动性和目的性，促进教学效果的积极化及教学效率的最大化，最终实现师生关系和谐发展，学生个性及素质的提高。情感作为学生精神生活的主宰，是学生学习的催化剂。尤其在英语听力课堂中，教师应合理调节和利用情感，努力调动学生的非智力因素。心理学研究表明，要想听懂某一听力材料，除了具备相应的专业知识，还须具备听的动机、自然放松的心境、较好的记忆力及意志力。如果学生处于焦虑、紧张的心态就会分散注意力，从而严重干扰听力理解，也就是语言输入的“情感过滤”问题。所以，从这点出发，军校英语教师要树立“以生为本”的素质教育理信念，激发学习动机、明确学习目的，强化学习兴趣，培养合作精神。军校学生是个特殊的群体，他们具有学生和军人双重身份。与同龄大学生相比，他们具有明显的三个特点：其一，接受正规化管理，具有严格的纪律要求，生活作息紧凑紧张；其二，生活空间相对固定，接触外界的时间和精力非常有限；其三，思维不够活跃，课堂气氛紧张而活泼不足。上述三个特点的形成与军校这个特定环境是密不可分的，首先，军校学生除了上课，课余时间还要参加体能训练、接受思想政治教育、学习条令条例，因此自由支配的时间非常有限。除此之外，军校更强调严格纪律的养成，学生接触的人和事非常单一，因此学生认知局限大、压力大，心理容易产生疲倦，易受外界干扰而产生焦虑或情绪波动。所以，根据军校学生生理、心理和认知特征，从英语学科的特点出发，笔者认为在英语听力课堂上应该从以下几方面实施情感教学。（一）加强英语听力策略训练，激发学生兴趣受应试教育影响，很多学生在高中阶段没有接受正规听力训练，所以在大学英语听力课堂上听懂的非常有限，于是就会产生紧张焦虑感。所以教师首先通过向学生阐释听力的特点、过程及方法，加强对学生的听力策略训练。任何活动的开展都以动机为前提，听力活动的有效进行同样依赖于学生动机的激发。学习动机能维持学生的学习活动，从来源上动机可以分为两类：内在动机和外在动机。内在动机直接与学习本身有关，由于学习活动本身能激发学生的浓厚兴趣，学习活动本身就是他们所追求的目的。外在动机是由外部力量和外部环境（即诱因）激发而来，与活动没有内在联系。在学校教育中，有多种多样的外部条件，可以吸引、激励学生，成为他们的动力源泉，如父母的鼓励、教师的表扬、竞争的奖励等等。（二）合理设计评价激励机制，激发学员参与性军校学生接受正规化管理，尤其重视教师对自己的评价。教师的评价直接影响学生的成就感及参与课堂积极性。所以，教师要采取多种评价、激励措施满足学生的需求。但在现行教育体制下，语言评价更多的是依靠单一的终结性评价，尤其是依靠试卷，这种评价方式不能全面地评价学生的进步，严重挫伤了学生学习语言的积极性，也对英语教学形成了负面影响。我国教育部制定的《大学英语课程教学要求》中明确提出教学评价分形成性评价和终结性评价两种：形成性评价是基于对学生学习全过程的持续观察、记录、反思做出的一种全新发展性评价方式，其目的是培养学生对自己进步过程的意识，使学生从被动接受评价转变成评价的主体和积极参与者。因此，在听力课堂中，教师不仅要重视终结性评价，更要重视学生在听力课堂上的表现，跟踪教学过程，如：学生主动发言、参与课堂小组活动等，更多地采取宽容、多元化的形成性评价方式，使学生逐渐养成主动获取知识和反我反思的学习习惯。（三）采取分组等合作方式，科学设置各种集体活动军校大学生由于受环境的制约，没有地方大学生的锻炼机会多，不利于听力能力的提高，所以教师更要在听力课堂上开展丰富多彩的活动促进对听力内容的理解及吸收。听力教学可以围绕语言目标，在学生对所听材料有一定理解的基础上、根据学生层次兴趣有效组织多种课堂活动，如：双人对话、小组讨论、分角色表演、复述听力内容等。另外，课堂听力活动可以结合网络、多媒体等现代化教学手段，增加活动的趣味性。这些活动一方面能鼓励学生参与其中，在真实的交际语境中达到培养语言交际能力的目的。在此过程中，学生也会把自身感情当作评估自己的标准，当感觉自己是群体中不可缺少的一员时，学生就会对自我价值产生认可。另一方面，学生能通过这些合作活动消除听力中的思想焦虑、促进合作意识，提高合作能力，体验集体荣誉感。而合作意识正是当代大学生必备的基本素质。当然，教师作为听力课堂活动的设计者，要充当好组织者、鼓励者和评价者的多重身份。（四）创设宽松、愉快、和谐的听力课堂气氛课堂不仅仅是教师教学、学生学习的地方交流，更是师生情感相互碰撞交融的地方。好的课堂气氛是一种隐性教育，指各种教学要素和关系达到一种动态的平衡与和谐，它对学生的自主性学习具有巨大的潜在影响，因为在这种氛围中，学生能轻松地获取知识，减轻自身学习焦虑感，并能激发学生学习英语的热情，变“厌学”为“愿学”。为了达到良好的互动交际，教师首先要保证课堂内外师生关系的平等，使学生在心理上觉得安全。鼓励学生大胆提出问题，唤起他们的成功欲望；要尽量给焦虑感强的学生提供感受学习成就感的机会，增强他们的自信心，帮助其形成良好的自我形象及对教师的依赖。对学生的语言输出错误要采取宽容的态度，并以委婉的态度引导他们自己发现并纠正错误，从而使不同层次水平的学生都能发挥自身的最大潜力。（五）教师要提高个人魅力及素养，调控教员自身的情绪状态教师除了要关注学员心理状态，在听力课堂上自身也要善于表达积极情感，用信任的目光、赞许的微笑、和蔼的语言，多给学生动口的机会，尽力做到对学生不指责、不呵斥、不急躁，多给予热情鼓励和引导，让他们在语言实践中主动发现问题、解决问题。从而表达出对学生的关心和爱护，消除师生之间的情感障碍，满足学生的情意需求。另一方面，在日常生活中要不断地与学生进行情感交流，以求进一步融洽师生感情。教师应把对学生的爱化为一个温柔的眼神、一个会意的微笑、一句暖心的话语、一个赞许的姿态、一个体贴入微的动作，公平公正地对待学生。对他们的点滴进步都给以鼓励，这样会使学生感觉到教师的关心、赏识和可敬，心理上就会产生一种说不出的愉悦与满足，激发他们的求知欲，鼓起他们英语听力的自信。这样，学生就会“亲其师而信其道”，更加热爱学习。总之，情感策略在大学英语听力实践中的积极作用是不容忽视的。军校大学英语教师应该关注学生在听力学习过程中的各种听力需求，通过有效的教学策略，培养他们的学习动机、学习兴趣。教师一定要结合实际情况，树立正确的人文教育观念，积极调动学生的人格因素，有效地利用现用的教学资源，努力帮助学生营造和谐、轻松、自然地学习氛围。分子免疫学_之_抗体的制备及应用怎样思想，就有怎样的生活分子48抗体的制备及应用抗体的制备及应用49一、抗体的一些基本概念单克隆抗体

(MonoclonalAntibody,McAb)单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体多克隆抗体

(PolyclonalAntibody)多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

一、抗体的一些基本概念单克隆抗体50抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇51Ag

单克隆抗体

B1B2B3B4B3B3B3B32

多克隆抗体341Ag单克521、单克隆抗体的特点特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！）因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。

抗体的性质相同，容易纯化、标记。1、单克隆抗体的特点特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不53脑垂体分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素hLH促黄体生成素hTSH促甲状腺激素hCG#绒毛膜促性腺激素βαβαα

β

βα脑垂体分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素βαβααβ54

单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反应）,或有相似的表位（不同程度的交叉反应）。单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有55产生凝集反应的原理113323221111112232322113产生凝集反应的原理11332322111111223232256购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验,使用浓度多少WB（Westernblotting，免疫印迹)IH(Immunohistochemistry,免疫组织化学)IC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫电镜)FCM(FlowCytometry,流式细胞仪)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验,使用浓度多少572、多克隆抗体的特点

多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。2、多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质58

比单抗更容易捕捉抗原。

因为含有抗不同表位的抗体，多种抗

体都可与抗原结合。

抗体的纯化、标记比单抗难因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多.比单抗更容易捕捉抗原。

因为含有抗不同表位的抗体，多59二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备无法采用生物化学的方法从多抗中分离必须采用细胞杂交的方法来制备能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问题也有机遇问题

二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备60制备单克隆抗体的基本原理：

致敏的B淋巴细胞骨髓瘤细胞（myeloma）

（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存）但能在体外长期生存）

阳性杂交瘤细胞(hybridoma)

（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养

（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体

1222212制备单克隆抗体的基本原理：1222212612、多抗的制备常用的免疫动物免疫的基本步骤如何免疫兔子2、多抗的制备621）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）1）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，63羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用。羊（sheep、goat）：常用于较大批量地642）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（ComplateFreund’adjuvand,含矿物油,卡介苗等).加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).2）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全65取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。(在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)取血测效价：663)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g）基础免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml）制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠67加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射加强免疫68免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)

免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价69单抗与多抗的区别

单抗多抗抗体组成单一复杂

抗体性质个体的属性群体综合的性质纯化标记容易，效果好难度高一些种属来源绝大多数是小鼠兔子、羊、豚鼠等制备周期长(最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少单抗与多抗的区别70什么情况需要制备单抗目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂什么情况需要制备单抗目的蛋白有结构类似物71三、抗体的纯化盐析法（硫酸铵沉淀)辛酸-硫酸铵沉淀法离子交换法亲和层析法凝胶过滤法三、抗体的纯化盐析法（硫酸铵沉淀)721、盐析法（硫酸铵沉淀)原理在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示(100%饱和度:767g/L)1、盐析法（硫酸铵沉淀)原理73主要步骤在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀；4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀；

可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度:5