基因工程研究生课件

南昌大学医学院万福生

GeneticEngineering基因工程1南昌大学医学院GeneticEngineering基因工程（geneticengineering）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。它的诞生和发展，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。2基因工程（geneticengineering）是人们在对生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。3生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目第一部分

DNA的重组

DNARecombination

4第一部分

DNA的重组

DNARecomDNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)5DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(t发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组6发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrHolliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)7Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。8片段重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图右边

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录9内切酶DNA侵扰分支迁移内切酶DNA5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录10Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。11二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子12可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。

13（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。14例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。14目录15目录15（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。16（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例目录17λ噬菌体的生活史溶菌生长途径例目录17目录18目录18三、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。例（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

19三、位点特异重组例（一）λ噬菌体DNA的整合19例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变20例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。21hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变22H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。

轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC23例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段24重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目录25V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。26四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因

IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座27插入序列(insertionsequences,IS)组插入序列的复制性转座目录28插入序列的复制性转座目录28转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座29转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移3030由转座子介导的转座目录31由转座子介导的转座目录31第二部分

重组DNA技术DNARecombinationTechnique32第二部分

重组DNA技术DNARecombina重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆33重组DNA技术相关概念克隆(clon技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）34技术水平：分子克隆(molecularclone)34DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。

35DNA克隆35重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。36重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试第二节

基因工程的物质基础

第三节

基因克隆的基本过程第四节克隆基因的表达第五节基因工程技术与医学的发展

第一节

基因工程的基本原理

37第二节基因工程的物质基础第三节基因克隆的基本过程第一节第一节基因工程的基本原理

一、基因工程技术的诞生及意义

二、基因工程技术的基本原理38第一节基因工程的基本原理一、基因工程技术的诞生及意义基因克隆的基本原理及过程

载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增39基因克隆的基本原理及过程载体目的基因重组DNA分子细菌转第二节基因工程的物质基础一、工具酶

（一）限制性核酸内切酶（二）DNA聚合酶(三)DNA连接酶(四)其它DNA修饰酶40第二节基因工程的物质基础一、工具酶40（一）限制性核酸内切酶

限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因工程操作中所说的限制酶，通常指Ⅱ类限制性核酸内切酶。41（一）限制性核酸内切酶41定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶,简称限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ42定义GGATCCGGATCC+BamHⅠ42作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）43作用分类43第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶44第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢⅡ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG45Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口46BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ47同功异源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA48同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG限制酶的性质和作用特点

限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5´-P、3´-OH的DNA片段。限制酶切割DNA分子形成黏性末端(stickyend)和平末端或钝末端(bluntend)两种。

49限制酶的性质和作用特点495´…CTGCAG…3´PstⅠ识别序列

3´…GACGTC…5´形成3´-OH黏性末端

5´…GAATTC…3´EcoRⅠ识别序列

3´…CTTAAG…5´形成5´-P黏性末端

5´…AGCT…3´Alu

Ⅰ识别序列

3´…TCGA…5´切割后形成平末端

505´…CTGCAG…3´PstⅠ识别序列限制性核酸内切酶的用途:

①改造和构建新质粒；②建立DNA物理图谱；③基因组DNA同源性研究；④基因克隆；⑤DNA分子杂交及序列分析；⑥制备DNA放射性探针；⑦DNA甲基化碱基的识别与切割等。

51限制性核酸内切酶的用途:51（二）DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）是基因工程中所必需的一类酶。它能催化DNA中相邻的5´-磷酸基和3´-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口连接起来，形成完整DNA分子。在基因工程中，最常用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。

52（二）DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）3´5´失去磷酸二酯键的缺口连接酶封闭缺口DNA连接酶连接双链中的单链缺口533´5´失去磷酸二酯键的缺口连接酶封闭缺口DNA连接酶连表8-1重组DNA技术中常用的工具酶

酶的名称功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA聚合酶①合成双链cDNA的第二条链②缺口平移制作高比活探针③填补3´末端逆转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析DNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成的磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基54表8-1重组DNA技术中常用的工具酶

酶的名称二基因载体定义载体（vector）为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。它是能携带外源DNA分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运载工具。常用载体质粒DNA,噬菌体DNA,病毒DNA.55二基因载体定义常用载体55（一）克隆载体1.质粒载体2.噬菌体载体3.酵母人工染色体载体

（二）表达载体1.大肠杆菌表达载体2.真核表达载体基因载体种类56（一）克隆载体基因载体种类56克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)

为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。57克隆载体(cloningvector)57基因载体应具备的条件：①具有自主复制能力；②有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（MCS）③具有一个或多个选择性遗传标记④分子量小，能容纳较大的外源DNA分子⑤具有较高拷贝数，便于分离提纯；⑥具有较高的遗传稳定性。

58基因载体应具备的条件：①具有自主复制能力；58

（一）克隆载体1.质粒

质粒（plasmid）是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的双链环状DNA分子。常用的质粒载体有pBR322(图8-3)、pUC系列及TA克隆载体等多种。

59（一）克隆载体59特点

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。60特点60616162626363pUC系列载体的优点：①具有较小的分子量和较高的拷贝数。②适用于组织化学方法检测重组体。③pUC载体系列的MCS与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在两类载体系列之间来回“穿梭”，使得克隆序列的测序极为方便。

64pUC系列载体的优点：64

TA克隆载体是专为克隆PCR产物而设计的一种特殊质粒载体，它们的共同点是在其多克隆位点两侧的3´末端携带有未配对的T碱基，多克隆位点均位于半乳糖苷酶的肽编码区内和都含有T7启动子。由于大部分耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都会有在PCR产物3´末端加上一个A碱基的特性，可与载体3´末端的T互补连接，同时3´端T突出端可以防此载体的自身环化，可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。常见TA载体有pBS-T、pGM-T、pCF-T、pGW-T等。65TA克隆载体是专为克隆PCR产物而设计的一种特殊质粒载6666

67672.噬菌体(bacteriophage，phage)M13噬菌体是一类细菌病毒，其为单链环状DNA分子,可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用克隆载体。M13噬菌体优点：一是允许包装大于病毒单位长度的外源DNA；二是它感染细菌后，其复制型是双链，分泌出来的则是单链。因此，M13噬菌体可用于DNA序列分析，制备单链DNA(探针)及进行定点突变研究等。682.噬菌体(bacteriophage，phage)686969

为了便于克隆外源DNA片段,在野生型噬菌体基因Ⅱ和基因Ⅳ之间插入lacy启动子-操纵元件序列扩编码β-半乳糖苷酶前145个氨基酸的核苷酸序列,并有多克隆位点,依据这些位点序列不同,构成M13mp系列,如M13mp2,M13mp10,M13mp18,M13mp19等.当细菌内复制型M13的拷贝数累积到100-200后,DNA的合成就变成不对称,只有一条链进行复制,从而产生大量的DNA单链,并包装到成熟的噬菌体颗粒中,然后排出细菌体外.70为了便于克隆外源DNA片段,在野生型噬菌体基因Ⅱ和基因Ⅳλ噬菌体DNA改造系统:λgt系列（插入型):能克隆7kb以下的外源DNA片段,适用cDNA克隆.EMBL系列（置换型):替代片段大小为9-23kb,适用基因组克隆.

71λ噬菌体DNA改造系统:71粘性质粒(cosmid)粘性质粒又称粘粒,由λ噬菌体DNA的cos区与质粒重新构建的载体,为双链环状DNA,具有与质粒相同的结构,但克隆容量比质粒大,其容量可达40-50kb.粘性质粒的特点为:

1.具有质粒的抗药性标记,如Ampr或Tetr基因及其复制成分;2.具有λ噬菌体的cos区,这是体外包装必须的成分;3.具有一个以上限制酶酶切位点;4.因非重组的粘粒很小,不能进行体外包装,有利于重组体的筛选.72粘性质粒(cosmid)粘性质粒又称粘粒,由λ噬菌体DNA的3.酵母人工染色体载体(YAC)

YAC是第一个成功构建的人工染色体载体，也是目前能容纳最大量(100万bp)外源DNA片段的载体.典型的YAC载体结构及基因克隆过程如下图所示。

733.酵母人工染色体载体(YAC)737474（二）表达载体（expressingvector）

表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列（如启动子、核糖体结合位点和转录终止调控序列等）。按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为原核细胞表达载体、酵母细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体和昆虫细胞表达载体。75（二）表达载体（expressingvector）75pRSET载体

它是一个两用载体，它既可作为表达融合型蛋白的载体，也可作为表达非融合型蛋白的载体。该载体含有Amp抗性基因和一个强的T7噬菌体启动子，在启动子与终止信号之间有RBS和多克隆位点。76pRSET载体767777

7878

真核表达载体都含有一套真核表达元件，即启动子/增强子、克隆位点、终止信号和加工poly(A)的信号。如pcDNA3.1载体（见图8-13）是常用的真核表达载体之一。该载体含有一个高效表达的CMV启动子、多克隆位点、原核细胞复制起始点、用于原核细胞筛选的Amp抗性基因和真核细胞筛选的抗性基因(Neor)及小牛生长激素的poly(A)。79真核表达载体都含有一套真核表达元件，即启动子/增强子

8080

腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,AAV）是一种细小病毒科依赖病毒属的单链DNA病毒。基因组全长4.6kb，共含2个结构基因，分别编码病毒复制和组装必需的蛋白质。基因组两端的反向末端重复序列（ITR）是腺相关病毒复制、整合及包装所必需的顺式作用元件。AAV载体可用于体内或体外感染肌肉、神经、肝及造血细胞，目前多用于-地中海贫血等单基因遗传病基因治疗的载体。

81腺相关病毒（Adeno-associatedviru

AAV载体的优点：①可感染多种细胞，包括非分裂期细胞；②免疫原性小、毒性低和致病性弱；③能特异地整合到人的19号染色体中;④它介导整合到人染色体中的外源基因能在人染色体中长期稳定表达。其不足之处:成熟病毒颗粒的形成需腺病毒或疱疹病毒协助和容纳外源基因的容量较小（约4kb）。用外源基因及其调控序列置换AVV的结构基因，保留其两端的ITR结构，可构建腺相关病毒重组载体，用于基因治疗。但重组AVV大多失去了野生型病毒整合人靶细胞基因组的特异性。82AAV载体的优点：①可感染多种细胞，包括非分裂期细胞第三节基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程主要应包括：①目的基因的获取；②基因载体的选择与构建；③基因载体与目的基因的连接（构建DNA重组体）；④DNA重组体导入受体细胞；⑤含DNA重组体细胞（转化子）或菌落的筛选与鉴定。83第三节基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程主要应包括：8基因克隆的基本过程

载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增84基因克隆的基本过程载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩

8585一、目的基因的获取(一)直接从基因组DNA中分离(二)化学合成法(三)逆转录法(四)聚合酶链反应(五)从基因文库中筛选获得86一、目的基因的获取(一)直接从基因组DNA中分离861.化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列871.化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.从基因组DNA文库获取目的基因目录88组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录89限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscmRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶

载体

受体菌

复制3.从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录90mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子4.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）方法PCR实际上是一种利用酶反应在体外获得基因组中特异的DNA序列或cDNA序列方法，多采用RT-PCR.该方法的特点是简便、快捷、特异性强、灵敏度高，是目前分子生物学中应用最广的新技术。另外,近来mRNA差异显示技术和差异蛋白质谱表达技术也被用来筛选差异表达基因和功能基因。

914.聚合酶链反应（polymerasechainreac5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录925Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录93Cycle35555555555模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分94模板DNAPCR体系基本组成成分94PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C95PCR的基本反应步骤变性延伸退火95（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途96（一）目的基因的克隆四、PCR的主要用途96几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术97几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术97实时PCR技术原理目录98实时PCR技术原理目录98二、基因载体的选择与制备基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作，它直接影响到基因克隆的成败。一般应从目的基因、所用限制酶及受体菌（细胞）的特性综合考虑。99二、基因载体的选择与制备基因克隆中基因载体的选择与构建是一项三、DNA重组体的构建（一）目的基因与基因载体的连接1.粘端连接法2.平端连接法3.人工接头连接法4.同聚物加尾连接法100三、DNA重组体的构建（一）目的基因与基因载体的连接1001.

粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接1011.粘性末端连接101BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连同一限制酶切位点连接目录102BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录103不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端1042.平端连接104目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录105目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。1063.同聚物加尾连接1065´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录1075´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

1084.人工接头(linker)连接108人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录109人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco（二）影响目的基因与载体连接的因素1.连接酶的活性大小2.连接反应的温度3.目的基因与载体DNA的比例

110（二）影响目的基因与载体连接的因素1.连接酶的活性大小11

连接酶的抑制剂:

目的基因与载体连接反应的实质是连接酶对两种DNA片段末端之间的催化反应，连接酶的活性大小直接影响到连接效果。连接酶的活性能被5mmol/L磷酸盐、25mmol/LNaCl和0.1mmol/LCa2+离子所抑制。所以，在连接反应中一定不能含有上述试剂，特别是当要求用高盐缓冲液的酶消化DNA后，必须用乙醇沉淀DNA以除去盐和限制酶，然后加入连接缓冲液进行连接反应。DDT可促进T4DNA连接酶的连接作用。111连接酶的抑制剂:111

连接反应条件:

对粘性末端片段的连接反应温度一般为12℃～15℃，反应过夜；最适pH为7.2-7.8.对平末端片段的连接反应温度一般在室温（22℃～25℃）下进行。

ATP的失活往往也是连接反应失败的重要原因之一。一般配制的4mmol/LATP母液要分装（每管20－50μl）、冰冻保存，使用前取出在冷水中融化，放在冰上备用。112连接反应条件:112

目的基因与载体DNA的比例:目的基因/载体DNA摩尔浓度的比值一般为2～3，这样能得到较高的重组率。连接反应中DNA总浓度不能过高，一般以1～50g/ml为宜，在DNA总浓度小于20g/ml范围内，重组率与DNA浓度成正比例。113目的基因与载体DNA的比例:113

表8-2部分常用的限制性核酸内切酶

DNA总浓度pM-V/pM-I转化子/重组子%(V+I）(μgV-DNA)(μg/mL)

12:17.0*1055.052:16.5*1057.0102:16.0*10514

202:14.5*10522502:12.0*1055.011:27.0*1052.0101:26.5*10530201:26.5*10522114表8-2部分常用的限制性四、重组DNA导入受体细胞

细胞(细菌)处于容易接受外源DNA状态叫感受态(competence)。细菌生物学特性由于吸源收外DNA发生可遗传的表型变化叫转化(transformation).通常将重组体导入原核细胞的过程称为转化，重组体导入真核细胞的过程称转染(transfection)，而由病毒载体构建的重组体导入细胞(细菌)被称为感染(infection)。常用受体细胞包括原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、哺乳动物及昆虫细胞等）。115四、重组DNA导入受体细胞细胞(细菌)处于容易接受真核细胞中介导基因转染方法（一）磷酸钙共沉淀法（二）脂质体法（三）DEAE-葡聚糖介导转染法（四）电穿孔法（五）显微注射法116真核细胞中介导基因转染方法（一）磷酸钙共沉淀法116五、筛选与鉴定将重组体引入受体菌(细胞)，并经初步扩增后，应进行筛选，即从大量转化菌落或噬菌斑中选择和鉴定出含有目的基因的菌株(细胞)，这一过程就称为筛选(Screening)或选择(Selection)。

117五、筛选与鉴定将重组体引入受体菌(细胞)，并经初步扩增后，应（一）根据DNA重组体表型筛选1.插入灭活法2.α-互补筛选法（二）限制酶酶谱分析法（三）核酸分子杂交（四）PCR扩增法（五）核酸序列测定（六）免疫学方法118（一）根据DNA重组体表型筛选118(插入失活法)抗药性标记选择目录119(插入失活法)目录119组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录120组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体α互补目录121α互补目录121

α互补的检测目录122α互补的检测目录122原位杂交目录123原位杂交目录123Southernblot目录124Southernblot目录124鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录125鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录125三、克隆基因在其它表达系统中的表达(一)杆状病毒表达系统

杆状病毒主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目类昆虫，具有高度特异性的宿主范围，对人、畜及其它动物无害。(二)果蝇表达系统果蝇表达系统是非溶解性的，使用果蝇S2细胞为受体细胞，载体含有MT启动子和Ac5启动子。表达载体可连续表达，也可诱导表达。

126三、克隆基因在其它表达系统中的表达126重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录127重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源第四节克隆基因的表达一、克隆基因在原核细胞中的表达（一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求（二）提高外源基因表达水平的方法二、克隆基因在真核细胞中的表达（一）酵母表达系统（二）哺乳动物细胞表达系统（三）哺乳动物细胞基因转染的筛选128第四节克隆基因的表达一、克隆基因在原核细胞中的表达128（一）真核基因在大肠杆菌表达的基本要求真核基因在原核细胞中表达的基本条件:①其5´端不能带有非编码区和内含子②外源基因必须置于原核细胞的强启动子（如PL、trp-lac及T7）和SD序列等调控元件下游。③外源基因与表达载体重组后，必须形成正确的开放阅读框架。④外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有效翻译，所表达蛋白质产物对宿主菌无毒害作用，且不易被宿主菌的蛋白酶降解。129（一）真核基因在大肠杆菌表达的基本要求129（二）提高外源基因表达水平的方式1.提高翻译水平主要策略和措施有：①调节SD序列与ATG之间的距离,一般为5-9个碱基。②利用密码的简并性合成一组恰当的密码子，以提高翻译效率。③增加mRNA的稳定性。2.错开目的基因表达与细菌生长的时间3.提高目的蛋白的稳定性4.增加转化细胞（菌）中目的基因的拷贝数130（二）提高外源基因表达水平的方式130（三）哺乳动物细胞基因转染后的筛选目前常用于筛选的基因有以下几种：1.

新霉素抗性基因2.胸苷激酶基因(thymidinekinase,TK）3.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）4.氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)

131（三）哺乳动物细胞基因转染后的筛选目前常用于筛选的基因有以下（四）外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物一般为四种形式：①融合蛋白(fusionprotein)：

指将外源基因与另一基因相拼接构成融合基因进行表达，这种由原核生物多和外源目的蛋白结合在一起的蛋白称融合蛋白。需要使用融合表达载体，如pET、pGEX系列载体等。其特点是利用与外源蛋白融合表达的特殊短肽（如6个组氨酸）或多肽（如谷光苷肽巯基转移酶，GST）作为标签，便于分离目的蛋白。132（四）外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物一般为四种形

融合蛋白表达的特点：A.融合蛋白表达的效率高；B.融合蛋白可抵抗细菌蛋白酶的降解；

C.大多数融合蛋白有较好的水溶性及构象；

D.常带有特殊标记，便于纯化。②非融合蛋白：非融合型表达的蛋白具有近似天然蛋白质的结构，其生物学活性也更接近天然蛋白质。其不足是易被细菌蛋白酶降解。133融合蛋白表达的特点：133

③：分泌型蛋白：

是利用分泌型表达载体将表达的蛋白质经胞质跨膜分泌到胞外，这需要在信号肽的帮助下进行。即在SD序列下游要有一段信号肽序列。分泌型蛋白可以是融合蛋白，也可以是非融合蛋白。表达分泌型蛋白的优点：一是可防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解；二是有利于表达蛋白在胞外正确折叠和分离纯化；三是能减轻宿主（如大肠杆菌）的负荷。不足之处：表达量往往较低，需要切除信号肽或信号肽切除错误。134③：分泌型蛋白：134

④包含体（inclusionbody）形式：

它是指所表达的蛋白质很致密地集聚在细胞内或被膜包裹形成的水不溶性结构称为包含体.它是无定型的蛋白聚合物，其中约50%为目的基因产物，还有宿主细胞蛋白片段及少量的脂多糖、DNA、RNA。包含体中目的蛋白的一级结构是正确的，但空间结构是错误的，重组蛋白失去原有生物学活性，需要复性操作以获得有活性的目的蛋白。其优点是可表达对宿主细胞有害甚至致死的目的蛋白，且表达的目的蛋白结构稳定，不被宿主蛋白酶降解。135④包含体（inclusionbody）形式：13包含体蛋白分离纯化方法一般步骤:

①破碎细胞，离心分离包含体，②用1%以下的中性去污剂如TritonX-100或盐酸胍等洗涤，去除吸附在包含体表面的不溶性蛋白。③用高浓度的变性剂如8～10mol/L尿素或5～8mol/L盐酸胍溶解包含体。④对重组蛋白进行复性处理，最简单的方法可用适当缓冲液透析，除去变性剂使蛋白质在适当条件下重新折叠成有生物活性的蛋白质。

136包含体蛋白分离纯化方法一般步骤:①破碎细胞，离心分离包含体重组蛋白的活性与下列因素有关：①分泌型蛋白质分子表面是否正确接上糖链，②是否正确形成二硫键，③是否形成具有生物活性的天然构象，④以溶解状态还是聚集在包含体中？137重组蛋白的活性与下列因素有关：①分泌型蛋白质分子表面是否正确第五节用DNA重组技术生产人胰岛素1921年，F.G.Banting和C.H.Best发现提取了胰岛素（insulin），之后与J.B.Collip和J.J.R.Macleod共同研究将胰岛素用于糖尿病治疗，为此Banting和Macleod于1923年获得诺贝尔生理学或医学奖。鉴于胰岛素的重要临床价值和DNA重组技术应用研究的逐渐深入，国际上开始有不同的医药公司进行基因工程胰岛素的研究与开发。1978年，美国Genentech公司首次实现了利用大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人胰岛素。138第五节用DNA重组技术生产人胰岛素1921年，F.G

1982年，美国EliLilly公司首先将由基因工程菌生产的药物—胰岛素投放市场，重组人胰岛素的开发生产标志着世界第一个基因工程药物的诞生。1987年，丹麦Novonordisk公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。2000年全球的胰岛素销售额为300亿美元，2003年已达到600亿美元，而基因工程胰岛素正占据越来越大的比例。Novonordisk公司的诺和灵(Insulin)、EliLilly公司的优泌林（Humulin）和优泌乐（Humalog）是销售额最大的三个基因工程胰岛素产品，全球年销售额都超过10亿美元。1391982年，美国EliLilly公司首先将由基因工程菌一、人胰岛素的生产方法

迄今为止，主要有以下几种生产人胰岛素的方法：（一）直接提取法这是早期生产人胰岛素的方法，直接从人的胰脏中分离纯化获取。该方法由于受原料供应的限制，其产量远远不能满足糖尿病人的临床需求。（二）化学合成法我国生物化学家花费8年时间于20世纪60年代中期，在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，这项成就开创了世界上人工合成蛋白质的新纪元，成为中国人永远为之骄傲的辉煌。140一、人胰岛素的生产方法

迄今为止，主要有以下几种生产人胰岛素

（三）化学转型法此法是将动物胰岛素进行化学处理，使其转变成人胰岛素。如猪的胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸残基的差异，因此在体外控制合适的反应条件，可将猪胰岛素酶促转化为人胰岛素。该过程的总转化效率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，因此产品的价格往往较高。另外，从动物（猪或牛）的胰脏组织中提取胰岛素，虽然原料相对丰富，但也面临含量低，产量少，价格高等问题。141（三）化学转型法141（四）DNA重组技术制备法上述生产人胰岛素方法的种种不利因素，医药公司就尝试利用DNA重组技术生产重组人胰岛素，EliLilly公司于1982年成功将重组人胰岛素投放市场。通过基因工程方法，把人工合成的编码胰岛素的基因送到大肠杆菌细胞中去，成功构建出能生产胰岛素的工程菌。大肠杆菌具有操作方便，易于培养，繁殖迅速等优点，因此重组人胰岛素一经问世就显示出巨大的市场前景，并带动了其它基因工程药物的研究与开发。

142（四）DNA重组技术制备法上述生产人胰岛素方法的种种不利因素二、重组人胰岛素的制备方法（一）A链和B链分别表达法（二）人胰岛素原表达法（三）A链和B链同时表达法（四）分泌型重组人胰岛素表达法143二、重组人胰岛素的制备方法（一）A链和B链分别表达法143（一）A链和B链分别表达法1．基因工程菌的构建①用T4DNA连接酶，把化学合成的A链和B链的寡核苷酸片段，连接成A链和B链的全长编码序列。并分别在A链和B链的N-末端氨基酸之前，添加Met的密码子（ATG），以便在融合蛋白中插入一个Met残基，供CNBr切割之用。②分别将胰岛素A链和B链基因插入质粒DNA，并与β-半乳糖苷酶（β-Gal）基因融合，构建融合表达载体。③分别将两个融合表达载体转入大肠杆菌细胞中，进行胰岛素A链和B链基因的融合表达。经过一段时间培养增殖后，分离纯化融合蛋白β-Gal-A和β-Gal-B。由于受到β-Gal的保护作用，胰岛素的A链和B链多肽不会被细菌蛋白水解酶所降解。144（一）A链和B链分别表达法1．基因工程菌的构建144

2．表达产物的后处理

①在体外经CNBr处理，胰岛素A链和B链从融合蛋白β-Gal-A和β-Gal-B中释放出来。②进一步分离纯化胰岛素A链和B链多肽。③将纯化的A链和B链多肽融合，经半胱氨酸（Cys）体外氧化和重折叠，形成有活性的胰岛素。1452．表达产物的后处理145

146146（二）人胰岛素原表达法1．基因工程菌的构建①采用RT-PCR方法，获取人胰岛素原cDNA序列。同时在胰岛素B链的N-末端氨基酸之前，设计加入ATG密码子，供CNBr从融合蛋白中特异性地将胰岛素原前体切割下来。②将cDNA序列插入质粒载体中，构建融合表达载体。③用融合表达载体转化大肠杆菌细胞，经扩增培养后，分离纯化含重组人胰岛素原的融合蛋白。由于在胰岛素原分子中存在C肽，有利于在A链和B链之间形成正确的二硫键。147（二）人胰岛素原表达法1．基因工程菌的构建147

2．表达产物的后处理

①在CNBr作用下，通过控制体外切割反应，使胰岛素原从融合蛋白分子上解离下来。②胰蛋白酶只能从Arg或Lys的羧基一侧切割肽链，而在C区段的末端或其附近有三个Arg残基，因此当用胰蛋白酶对融合蛋白作短暂处理时，就会在A链和C肽之间的一个正确位置发生切割作用，或者在B链羧基末端留下一两个额外Arg的切割。③用羧基肽酶B将B链羧基末端多余的Arg切除。1482．表达产物的后处理148

149149

3．生产技术的评价由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然该工艺路线并不比A、B链分别表达法更为简捷，而且还需要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本比原来降低一半。目前EliLilly公司采用此工艺年产十几吨重组人胰岛素。1503．生产技术的评价由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好（三）A链和B链同时表达法本工艺路线与A链和B链分别表达法基本相似，主要区别在于：前者将化学合成的AB链编码序列同时克隆至表达载体，表达融合蛋白β-Gal-B-A；而后者分别将化学合成的A链和B链编码序列克隆至载体，分别表达融合蛋白β-Gal-A和β-Gal-B。151（三）A链和B链同时表达法本工艺路线与A链和B链分别表达法基

大体流程如下：先化学合成AB链的编码序列，在B链的N-端氨基酸之前，添加ATG密码子；与β-半乳糖苷酶基因融合后，将表达载体转化到大肠杆菌中；扩增培养后，从中分离纯化融合蛋白β-Gal-B-A；体外经CNBr处理，将β-Gal切除；再经蛋白酶特异性裂解，使胰岛素A链和B链分离；最后经体外氧化折叠，形成有活性的重组胰岛素。152大体流程如下：先化学合成AB链的编码序列，在B链的N-端（四）分泌型重组人胰岛素表达法前三种基因工程菌的构建均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包含体的形式存在于胞质中。153（四）分泌型重组人胰岛素表达法前三种基因工程菌的构建均采用胰

一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-內酰胺酶基因拼接，此酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。154一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素（一）疾病相关基因的分析与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。1.定位克隆(positionalcloning):它是指从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。

2.功能性克隆（fuctionalcloning）:它是指从一种致病基因功能的理解出发克隆该致病基因的方法。第六节基因工程与医学的关系（二）生物制药155（一）疾病相关基因的分析与克隆第六节基因工程与医学的关重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝目录156重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激截至2009年底，中国国家食品药品管理局（SFDA）批准上市的以重组DNA技术获得的生物制品共480多例，其中10例为乙型肝炎疫苗，1例为重组人5型腺病毒，1例为重组人P53腺病毒DNA产品，其它多为细胞因子，激素等，如表皮生长因子。血管内皮抑制素抗肿瘤药物——“恩度”是我国自主研发的新药。157截至2009年底，中国国家食品药品管理局（SFDA）批准上市重组药物的发展趋势1.从天然产物中筛选可供基因重组的药物

从动物,植物和微生物中发现或找出一批具有药用价值的蛋白或多肽类,并对其进行人工改革造和重组表达,这是开发创新药物的一条捷径.当前,许多科学家看出丰富海洋资源的重要意义.2.挖掘新基因和新蛋白

通过功能基因组学的研究,发掘一些新基因.在这方面,因我国人口众多,具有疾病资源丰富的优势,可从中挖掘出新基因或新蛋白用于基因重组药物的候选分子.158重组药物的发展趋势1.从天然产物中筛选可供基因重组的药物15

3.通过发现药物作用新靶点开发新药

采用新的技术方法,发现一些药物新的作用机制,从中找出新的药物靶点,也可为新药的源头创新提供依据.目前,将功能基因组学,生物信息学,药物基因组学,蛋白质组学,RNA干扰及计算机辅助设计等新技术,新方法用于药物靶点的寻找和筛选.这是研发新重组药物的一个重要途径.1593.通过发现药物作用新靶点开发新药159

4.改造现有蛋白多肽类药物以获新药

对已有治疗作用的药物进行蛋白质改造,使它成为靶向性更强,毒副作用小,疗效更好的新药.同时,又可避免药物知识产权纠纷.如TNFα,由于其严重的毒性(如肝毒性和低血压)不能作全身用药,通过蛋白质工程技术可对TNFα分子中某些氨基酸置换,从而得到一些毒性较低,疗效更好的TNFα分子.1604.改造现有蛋白多肽类药物以获新药160（三）对基因进行改造1.对特定基因进行定点诱变PCR技术适合进行基因的定点诱变2.利用定点诱变技术可改变基因和蛋白的特性如通过定点诱变制备长效胰岛素:将人胰岛素B链27位的Thr改为Arg,B链羧基端氨基化,A链21位的Asn改为Gly后,可大大延长其半衰期.161（三）对基因进行改造1.对特定基因进行定点诱变161

162162基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（四）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断163基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析164×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析165+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰RLFP分析法166RLFP分析法166分子杂交实验①②③目录167分子杂交实验①②③目录167放射自显影照片目录168放射自显影照片目录168DNA点阵目录169DNA点阵目录169标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。170标准170（五）基因治疗定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)171（五）基因治疗定义方式1711.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（六）遗传疾病的预防1721.产前诊断（六）遗传疾病的预防172南昌大学医学院万福生

GeneticEngineering基因工程173南昌大学医学院GeneticEngineering基因工程（geneticengineering）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。它的诞生和发展，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。174基因工程（geneticengineering）是人们在对生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。175生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目第一部分

DNA的重组

DNARecombination

176第一部分

DNA的重组

DNARecomDNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)177DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(t发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组178发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrHolliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)179Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。180片段重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图右边

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录181内切酶DNA侵扰分支迁移内切酶DNA5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´