昆虫抗性监测与治理课件

昆虫抗性监测与治理唐振华中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所昆虫抗性监测与治理唐振华1内容昆虫抗药性及其现况抗药性机理及其分子基础抗性早期诊断技术抗性治理策略我们在该领域的研究进展展望内容昆虫抗药性及其现况2抗药性

昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力在其群体中发展起来的现象。也就是说，在多次使用药剂后，害虫对某种药剂的抗药力较原来正常情况下有明显增加的现象，其特点是这种由使用药剂而增大的抗药力，是可以遗传的。有些昆虫对某些杀虫剂表现一种天然的敏感度低，即具有高度耐受性，我们把这种先天性的抗药能力称为自然抗性(natureresistance)1.昆虫抗药性及其现况抗药性昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力3交互抗性

昆虫对一种药剂发生抗性后往往对其它没有使用过的药剂也发生抗性，这叫做“交互抗性”(crossresistance)。一般来讲，作用机理机同的杀虫剂易产生交互抗性。因为产生交互抗性的原因主要是由某些杀虫剂的作用机理或代谢机理类同所致。也就是说，由于其抗性机理相同可对不同杀虫剂产生交互抗性。1.昆虫抗药性及其现况交互抗性昆虫对一种药剂发生抗性后往往对其它没有使4负交互抗性

负交互抗性(negativecrossresistance)是指昆虫对一种杀虫剂发生抗性后对另一种杀虫剂的敏感度反而上升的现象。1.昆虫抗药性及其现况负交互抗性负交互抗性(negativecros5多种抗性

多种抗性(multipleresistance)指昆虫对同时使用的几种杀虫剂产生抗性的现象，但这种抗性对几种杀虫剂的保护机制是不同的，切勿与交互抗性相混淆。区别这两种抗性是很重要的，因为一个特殊的交互抗性型常能提供与抗性机制有关的信息。1.昆虫抗药性及其现况多种抗性多种抗性(multipleresist6抗性发展的现况

据不完全统计至2003年，已报道对杀虫剂和杀螨剂产生抗性的昆虫和螨有548种，抗性虫种分布于15个不同的目：蜱螨目、蛛形目、鞘翅目、革翅目、双翅目、蝣目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、脉翅目、直翅目、虱目、蚤目和缨翅目，其中最多的是双翅目、蜱螨类、鳞翅目、鞘翅目和同翅目昆虫，这5个目的抗性虫种约占全部抗性虫种的90%以上。其中对杀虫剂和杀螨剂产生抗性最多的虫种是蝇、蚊，其次为螨、蜱、蝶，蛾、甲虫和半翅目昆虫(包括蚜虫、蝉、叶蝉、飞虱、介虫和粉虱)。自20世纪60年代发现害虫和害螨的抗药性以来，具有抗性药性的害虫和害螨种类数量在不断地增加，特别是在70年代以后，20世纪昆虫和螨类产生抗性的情况见下图1.昆虫抗药性及其现况抗性发展的现况据不完全统计至2003年，已报道对7

抗性事例数(虫种化合物)

昆虫和螨的种类数

杀虫剂和杀螨剂化合物数

在昆虫和螨中报告产生抗性的增长情况

1.昆虫抗药性及其现况

抗性事例数(虫种化合物)

昆虫和螨的种类数

杀虫剂和杀螨8orderNumberofresistantspeciesPercentoftotalnumberofresistantspecies（548）Diptera

18434Acari8315Lepidoptera8215Coleptera7313Homoptera5811total48088

Mostresistantarthropodorderstoinsecticidesoracaricides1.昆虫抗药性及其现况orderNumberofresistantspeci9Mostresistantarthropodspeciestoinsecticidesoracaricides

SpeciesNumberofpesticides

Tetranychusurticae72Plutellaxylostella69Myzuspersicae68Boophilusmicroplus41Leptinotarsadecemlineata40Panonychusulmi40Blattellagermanica39Heliothisvirescens37Muscadomestica36Triboliumcastaneum341.昆虫抗药性及其现况Mostresistantarthropodspeci10

杀虫剂的作用及抗性机理

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示杀虫剂抗性的主要机理

2.抗药性机理及其分子基础杀虫剂的作用及抗性机理2.抗11昆虫应用的各种反应，具有代谢各种有机化合物的能力。它们的代谢物通常具有更大的亲水性(一般低毒或无毒)，这样易于排出体外。许多抗性昆虫抵抗杀虫剂的能力明显增加，加速代谢杀虫剂，使这些杀虫剂变为无毒或低毒化合物，从而使杀虫剂无法到达作用部位，由此而产生的抗性称为代谢抗性(metabolicresistance)这是昆虫的一种重要抗性机理。这类代谢能力增高是由于解毒酶的上调节(up-regulation)所致。这种上调节的增加可由细胞色素P450s和/或GSTs的转录过表达，或由水解酶基因的扩增所致。

代谢抗性2.抗药性机理及其分子基础昆虫应用的各种反应，具有代谢各种有机化合物的能力。它12代谢抗性相关的三大酶系酯酶（Est）P450单加氧酶(P450s)，又称多功能氧化酶(MFOs)谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)2.抗药性机理及其分子基础代谢抗性相关的三大酶系酯酶（Est）2.抗药性机理及其分子13代谢抗性的分子机理尖音库蚊(Culexpipiens)对有机磷杀虫剂的抗性主要涉及3个等位基因，其中2个基因座为Est-2(或酯酶B)和Est-3(或酯酶A)，它们是编码解毒羧酸酯的水解酶的酯酶基因，赋予酯酶过量产生的抗性等位基因。至今在酯酶B基因座发现有6个不同的同种异酶(allozymes)：B1、B2、B4、B5、B6和B7；在酯酶A基因座有4个不同的同种异酶：A1、A2、A4和A5。这2个酯酶基因座是紧密连锁的，之间由2~6kb的基因间隔的DNA片段把它们分隔开。同种异酶是指相同基因位点上不同等位基因所编码的不同形式的酶。第三个基因座是Ace1，编码乙酰胆碱酯酶，是一个敏感度降低（不敏感）的等位基因。2.抗药性机理及其分子基础代谢抗性的分子机理尖音库蚊(Cule14

与杀虫剂的结合能力的增加,从而减少到达靶标部位杀虫剂的量加速杀虫剂的代谢。抗性昆虫中的酯酶量的改变2.抗药性机理及其分子基础与杀虫剂的结合能力的增加,抗性昆虫中的酯酶量的改变2.15酯酶的过量的分子机理酯酶的过量产生是由2种独立的机理引起的。第一种机理是基因扩增，既可是酯酶B基因座扩增，又可是酯酶A基因座扩增，在某些情况下还可是酯酶A和B基因座一起扩增。后者是2个酯酶基因座共扩增(co-amplification)。

第二种机理为基因调节(generegulation)，用以解释酯酶A1的过量产生。但是，除了基因扩增外，还有基因调节可贡献于其他变异体的过量产生。

2.抗药性机理及其分子基础酯酶的过量的分子机理酯酶的过量产生是由2种独立的机理引起的。16抗性昆虫中的酯酶质的改变

与有机磷抗性相关的酯酶除了量的变化外，还存在质的变化。这种质的变化的基础可能涉及酯酶的结构改变，从而增加其降解杀虫剂的能力例如:家蝇和铜绿蝇中色氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)2.抗药性机理及其分子基础抗性昆虫中的酯酶质的改变与有机磷抗性相关的酯酶除了17在抗性昆虫中P450的过表达抗性虫种(品系)过表达的P450参考文献抗性家蝇(Rutgers)CYP6A1Carino等，1992；1994。抗性家蝇(LeranPyrR)CYP6D1Scott等，1996。

抗性果蝇CYP6A2Waters等,1992;Brun等,1996。抗性果蝇CYP6A9Maitra等，1996。

抗性棉铃虫CYPB2Xiao-Ping和Hobbs,1995。吴峻等，1999。抗性烟芽夜蛾CYP4G8Pittendrigh等,1997。

CYP9A1Rose等，1997。2.抗药性机理及其分子基础在抗性昆虫中P450的过表达抗性虫种(品系)18抗性昆虫中GST酶量的改变基因扩增基因转录速率加快尚未发现GST酶的质的改变2.抗药性机理及其分子基础抗性昆虫中GST酶量的改变基因扩增2.抗药性机理及其分子基19靶标抗性

靶标敏感度降低是昆虫产生靶标抗性的第二种主要机理。一般来讲，杀虫剂进入昆虫体内经活化，或未被代谢的杀虫剂与靶标分子、靶标蛋白结合互相作用，改变其功能，结果产生中毒症状，最后死亡。由于抗性昆虫的靶标分子发生了变化，从而降低其与毒剂的结合作用，或降低与杀虫剂的作用，这种因敏感性降低而产生的抗性。称为靶标部位抗性(或靶标抗性)(target-siteresistance)。

2.抗药性机理及其分子基础靶标抗性靶标敏感度降低是昆虫产生靶标抗性的第二种20杀虫剂作用的主要靶标有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标

乙酰胆碱酯酶(AChE)滴滴涕和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标

钠离子通道环戊二烯类杀虫剂的作用靶标

-氨基丁酸(GABA)受体氯离子通道

2.抗药性机理及其分子基础杀虫剂作用的主要靶标有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标21靶标抗性的分子机理乙酰胆碱酯酶敏感度降低(InsensitiveAChE)GABA受体突变(GABAreceptormutation)电压门控钠离子通道突变(mutationsinthevoltage-gatedsodiumchannel)2.抗药性机理及其分子基础靶标抗性的分子机理乙酰胆碱酯酶敏感度降低(Insensiti22

品系115199303368位置

SaltilloSerValAlaTyr突变

BygdeaPheValAlaPhePierrefeuPheThrAlaPheMH19PheIleGlyTyrSensitivePheIleGlyPhe

果蝇AChE基因（Ace中的抗性突变）2.抗药性机理及其分子基础乙酰胆碱酯酶敏感度降低

23

家蝇抗性品系中发现的氨基酸点突变

抗性品系突变位点49R G365ACH2 G262AF327Y77M V180L G262A F327Y690ab G262V F327YCT V180L G262A F327YYBOL

V180L G262V F327YSH-PR V180LG262V F327YD422V

2.抗药性机理及其分子基础家蝇抗性品系中发现的氨基酸点突变2.抗药性机理及其分子基24抗性比抗性比果蝇单个和组合突变(以单字母氨基酸符号表示)对AChE抗性的影响

2.抗药性机理及其分子基础抗性比抗性比果蝇单个和组合突变(以单字母氨基酸符号表示)对A25

AChE敏感度降低的埃及伊蚊Ace基因的定向突变

2.抗药性机理及其分子基础

2.抗药性机理及其分子基础26GABA受体突变(GABAreceptormutation)

RDLGABA受体亚基的四个跨膜区（黑色矩形）和保守的半胱氨酸桥（C=C），将每二个跨膜区（M2）放大可见抗性突变位点S丙氨酸(Aly)丝氨酸(Ser)2.抗药性机理及其分子基础GABA受体突变(GABAreceptormutatio27电压门控钠离子通道突变

钠通道结构的模式图[(a)根据表25.6中所列文献；图(b)、(c)仿Vais等(2001)修改]a表示多种昆虫与kdr抗性相关的突点位置[图中编码是根据家蝇para序列(见GenBankX96668)；b表示离子孔周围跨膜螺旋片段的方向；c表示根据诱变和光亲和性标记试验所表明的部分麻醉剂(localanesthetics,LA)、双鞭甲藻毒素(brevetoxin,pbTx)和拟除虫菊酯(pyrethroids,Py)与S5和S6片段结合部位位置的放大示意图。

2.抗药性机理及其分子基础电压门控钠离子通道突变28医昆kdr型抗性涉及的突变及其在Na+通道中的部位结构域kdr突变部位虫种文献结构域ⅠS4-S5内环

I253VDmLee和Soderlund(2001)N端(ⅠS6-ⅡS1

接头)的ⅠS6处D58GBgLiu等(2000)近ⅠS6处

E4334KBg

Liu等(2000)近ⅡS1处

C764RBg

Liu等(2000)结构域Ⅱ

S6L1014FMdWilliamson等(1996)S6L1014FHiGuerrero等(1997)S6L1014FAgMartinez-Torres等(1998)S6L1014FCpMartinez-Torres等(1999b)

S6L1014SCpMartiney-Torres等(1999b)

AgRanson等(2000)

S6L1029HHvPark等(2000)S4-S5内环

M918T*MdWilliamson等(1996)

HiGuerrero等(1997)PcLee等(2000)

S6L993FBgDong等(1997);Liu等(2000)2.抗药性机理及其分子基础医昆kdr型抗性涉及的突变及其在Na+通道中的部位2.抗药29结构域Ⅲ

S6M1524IDmLee和Soderlund(2001)S6M1536IDmDoyle等(1998)S6F1550IBmPittendrigh等(1997);He等(1999)S5-S6A1494VDmPittendrigh等(1997)S5-S6V1410ADmPittendrigh等(1997)ⅢⅣ5´端

结构域ⅣS65´端P1880IBgLiu等(2000)Dm：黑腹果蝇(D.melanogaster)Md：

家蝇(M.domestica)

Cp：尖音库蚊(C.pipiens)Ag：冈比亚按蚊(A.gambiae)Bg：德国小蠊(B.germanica)Hi：搔扰角蝇(H.irritans)Pc：头虱(P.capitis)Bm：微小牛蜱(B.microplus)*super-kdr突变

结构域kdr突变部位虫种文献2.抗药性机理及其分子基础结构域Ⅲ结构域k30抗性早期诊断技术

在通常情况下，在田间防治失效时，抗性已是比较高了，只能换用无交互抗性的杀虫剂。抗性治理只有在抗性基因频率较低时才有效，所以必须对抗性种群进行抗性监测。

3.抗性早期诊断技术抗性早期诊断技术在通常情况下，在田间防治失效时，31区分剂量（discriminatingdosage）

技术首先获得该虫种的SS个体，即敏感纯合子品系，对某种杀虫剂的敏感度基线(base-linedata)，然后用该品系的LC99.9(或LD99.9)的剂量处理，存活的个体即为RS和RR个体。该方法的缺点是：①要通过遗传杂交的方法来纯化品系，较繁琐、费时；②难以真正完全区分RS和RR个体；若RS呈隐性，则无法将SS和RS分开；③无法了解其抗性机理。3.抗性早期诊断技术区分剂量（discriminatingdosage）

技术32

F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分离情况“a”具有典型的1:1分离，“b”没有明显的诊断剂量3.抗性早期诊断技术F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分离情况333

基于酯酶的测定方法(1)

应用高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)测定单个蚊虫的酯酶活性。酯酶水解模型底物-醋酸萘酯为醋酸和-萘酚，后者与染料固蓝盐B反应生成一种蓝紫色物质(λ=550~600nm)，用分光光度测定，以其光密度为酯酶活性。Pasteur和Georghiou（1989）根据这个原理，发展了测定单个昆虫的酯酶滤纸快速测定法。即取单个昆虫匀浆液（磷酸缓冲液）少许，点滴于滤纸上（在此滤纸为携酶的载体），然后浸入含有-­醋酸萘酯（底物）的磷酸缓冲液1min后取出，再浸入含有显色剂的染色液，晾干后对色斑的大小和强度进行测定和比较。

3.抗性早期诊断技术

基于酯酶的测定方法(1)

应用高效液相层析(h34

微量滴度酶标板法（microtiterplateassay）测定了单个烟芽夜蛾幼虫的酯酶活性。测定底物为以对硝基苯乙酸(p-nitrophenylacetate,PNPA)。酶液制备：取单个幼虫中肠，加500L匀浆缓冲液，用Polytron匀浆10s。然后进一步匀浆(1000g,2min)，上清液为酶源。酶源以1:150比例用0.1mg/L磷酸钠缓冲液(pH7.6)稀释，保温液含100L稀释的酶液和0.5mmol/LPNPA,最终容积为200L。应用Thermomax微量滴度板酶标仪在30℃，405nm处进行检测。每15s测定一次反应，总共测定15min保温期。用96孔酶标板为载体，依次在每孔穴中加入一定量的底物（-醋酸萘酯）和单个昆虫的酶液，在室温保温30min后，加入显色剂，置于便携式酶标仪下对96孔板读数（microtiterplateassay）。

上述的2种方法的优点是能快速、准确地测定与酯酶活性增高相关的抗性个体。缺点是无法区分由酯酶性质改变而引起的抗性。

基于酯酶的测定方法(2)

3.抗性早期诊断技术微量滴度酶标板法（microtit35基于P450单加氧酶的(微量)滴

度酶标板测定方法

应用对硝基茴香醚（p-nitroanisole，PNA）或甲氧基试卤灵（methoxyresorufin，MRR）作为P450加氧酶的底物。酶液制备用单个昆虫中肠在500L匀浆液中匀浆10s，然后离心（1000g,2min），上清液作为酶源。保温液为75L匀浆液，10LNADPH再生系统[0.25mmol/LNADP+、2.5mmol/L葡萄糖-6-磷酸、1个单位葡糖-6-磷酸脱氧酶（glucose6-phosphatedehydrogenase，G6PD）]和1~5mmol/LPNA，最终体积为200L。然后用Thermomax微量滴度酶标板读数仪在30℃，405nm测定

3.抗性早期诊断技术基于P450单加氧酶的(微量)滴

度酶标板测定方法36

基于GST的快速测定法

GST活性生化测定比较复杂，而且要用分光光度计等仪器才能测定。最近Vontas等（2000）发展了一种简便的定量测定的GST活性的方法，也可用于单个昆虫的测定。在测定中应用GSH和CDNB在一个固定时间内获得线性的酶反应后，在化学计量上应用碘(滴度)法（iodometrictitration）测定游离的GSH，最后从不同的颜色范围获得测定结果。即用碘的滴度来测定GSH。用淀粉作为内指示剂，因为在淀粉溶液中碘化汞抑制GST活性，终止酶反应。Brogdon和Barber(1990)应用微量滴度板测定了单个蚊虫的GST活性。

3.抗性早期诊断技术

基于GST的快速测定法

GST活性生37基于乙酰胆碱酯酶的测定方法

以模型底物乙酰硫代胆碱碘化物和5,5´-二硫-双（2-硝基苯酸）进行Ellman反应(Ellman等，1961),在存在少量AChE时产生黄色（OD412）。这种技术可用于检测不敏感的AChE。如果单个昆虫的样品一分为二，一个样品在反应混合液中含有一个诊断浓度的杀虫剂；而另一个样品的反应液中仅含有底物（无杀虫剂），根据有无产生黄色，则可区分不同敏感性的变异体。

这种技术在几种昆虫中已作了测定，并运用动力学软件作了进一步改进，采用微量孔板读数系统（microplatereadersystem）进行自动检测，可检测单个昆虫的抗性基因型。斑点印迹（dot-blot）检测技术也已用于检测田间抗性个体的AChE。

3.抗性早期诊断技术基于乙酰胆碱酯酶的测定方法以模型底物乙酰硫代38

基于Kdr的电生理测定方法

应用电生理技术检测Kdr。通常运用昆虫的神经肌肉制备体来测定自发性微小兴奋性后突触电位（miniatureexcitatorypostsynapticpotentials，mEPSPs）和对不同浓度的拟除虫菊酯或滴滴涕杀虫剂反应引发的兴奋性后突触电位（EPSPs）。细胞内记录显示拟除虫菊酯诱发mEPSP活性增加，而EPSP值下降，而在抗性昆虫中要高浓度才能诱发。然后与敏感昆虫相比较，就能检测有无Kdr存在。3.抗性早期诊断技术

基于Kdr的电生理测定方法

应用电39基于PCR的抗性检测的诊断技术特异性等位基因的PCR扩增（PCRamplificationofspecificalleles，PASA）单链构象多态性分析（singlestrandedconformationalpolymorphism,SSCP）PCR限制性内切酶核苷酸(PCRrestrictionendonucleasenucleotide,PCR/REN)分析法（详见唐振华和毕强编著的《杀虫剂作用的分子行为》，2003）3.抗性早期诊断技术基于PCR的抗性检测的诊断技术特异性等位基因的PCR扩增（P40抗性种群的演化4.出抗性治理策略抗性种群的演化4.出抗性治理策略41

影响抗性演化的主要因子

遗传学

生物学/生态学操作

4.出抗性治理策略影响抗性演化的主要因子遗传学4.出抗性治理策略42遗传学1.抗性等位基因频率

2.抗性等位基因数目

3.抗性等位基因的显性

4.外显性(penetrance)、表达性(expressivity)、抗性等位基因的相互作用

5.过去使用其它杀虫剂的选择作用

6.抗性基因组与适合度因子整合作用的程度，即抗性基因型和表现型在有或无杀虫剂时的适合度(fitness)4.出抗性治理策略遗传学1.抗性等位基因频率

2.抗性等位基因数目

3.抗性43生物学/生态学

生物/生态学1.繁殖力，包括世代的长短和每代的虫数

2.单配性/多配性；孤雌生殖

3.气候和其它生态条件行为1.隔离；移动性；迁飞

2.单食性/多食性

3.幸存；庇护4.出抗性治理策略生物学/生态学

生物/生态学1.繁殖力，包括世代的长短和每代44操作因子

化合物1.杀虫剂的化学性质

2.用药历史

3.杀虫剂的残效期

4.剂型施药情况1.施药的限阈

2.选择限阈

3.施药时的虫期（卵、幼虫或成虫）

4.限制防治空间

5.施药方式

6.用药次数4.出抗性治理策略操作因子

化合物1.杀虫剂的化学性质

2.用药历史

3.杀虫45抗性治理的策略根据不同的具体情况分为3类：①适度治理（managementbymoderation）②饱和治理（managementbysaturation）③复合作用治理（managementbymultipleattack）。

术语“适度”和“饱和”主要是指防治时所用药剂的剂量而言。“复合作用”这个术语用来表示长期或短期的多种作用的化学选择压。总之，所用的剂量应尽可能保留种群中的敏感基因。这3类措施并不是完全孤立的，在同一个防治计划中，这些措施可互相渗透。这完全取决于所处的实际情况。4.出抗性治理策略抗性治理的策略根据不同的具体情况分为3类：4.出抗性治理策略46抗性治理的化学防治策略适度治理饱和治理复合作用治理低剂量，留一部分敏感基因型个体；减少杀虫剂使用次数；应用残效期短的药剂；避免使用缓释剂；定向选择成虫；局部而不是全面施药；某一代或留下一部分种群不处理；保持“庇护所”；提高防治限阈使用高剂量，使R基因表达功能隐性；用增效剂抑制解毒机制药剂混用；药剂轮用；药剂镶嵌式交替防治换用改变靶标的新药剂；杀虫剂的剂型工艺4.出抗性治理策略抗性治理的化学防治策略适度治理饱和治理复合作用治理低47我组在该领域的研究进展

建立抗性演化的模拟系统5.研究进展我组在该领域的研究进展建立抗性演化的模拟系统5.48抗性演化的模拟系统

5.研究进展抗性演化的模拟系统5.研究进展49抗性由同一基因座上的两个等位基因R和S控制的抗性害虫种群在一种杀虫剂作用下，种群个体的基因型可分成RR、RS和SS三种形式。根据群体遗传学原理，在平衡种群中，三种基因型个体各自所占的比例分别为p2、2pq和q2。因此，Nt+1=Nt+1RR+Nt+1RS+Nt+1SS={(1-qc)[dbα+(1-bn)W1]pt2Nt(1-de)(1-de)+df2Mi}exp[rRR(1-Mtp/K)]+{2(1-qc)[hbn+(1-bn)W2]ptqtNt(1-dc)+2hf(1-f)Mi}exp[rRS(1-Mt/K)]+{(1-qc)[bα+(1-bα)W3]qt2Nt(1-de)(1-dc)+(1-f)2Mi}exp[rss(1-Mt/K)]Mi=[W1Pt2+2W2ptqt+W3qt2(1-bn)+[(dpt2+2hptqt+qt2)bn]Nt(1-de)(1-de)qtNa=[(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn)+(dpt2+2hptqt+W3qt2)bn](1-dc)(1-de)qcMt=[(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn)+dpt2+2hptqt+qt2)bα]Nt(1-dc)(1-dc)-Na+Mi[df2+2hf(1-f)+(1-f)2]Pt+1=(2Nt+1RR+Nt+1RS)/2Nt+15.研究进展抗性由同一基因座上的两个等位基因R和S控制的抗性害虫种群在一50害虫种群在以下模拟情况下不同的世代用药策略处理后的R基因频率变化N0:起始种群大小；P0：起始基因频率；K：环境容量。A：逐代处理（单剂）；B：两种杀虫剂轮用；C：与增效剂混用；D：两种杀虫剂混用；E：两种杀虫剂镶嵌式防治。世代R基因频率计算机模拟5.研究进展害虫种群在以下模拟情况下不同的世代世代R计算机模拟5.研究51抗性昆虫的适合度

适合度（fitness）是指昆虫的生存和繁殖能力，可以通过测定寿命、发育期间的死亡率和单性和两性的生殖率来获得。相对适合度是通过测定抗性品系的能力与混合种群中敏感品系的能力相比较而得。

5.研究进展抗性昆虫的适合度适合度（fitness）是指昆虫52停止筛选F34F56LC50(mg/L))淡色库蚊在用马拉硫磷汰选和停止汰选后对马拉硫磷的抗性演化

5.研究进展停止筛选F34F56LC50(mg/L)53

不同基因型的适合度

基因型相对适合度

SS1.0RS0.65RR0.65.研究进展不同基因型的适合度5.54淡色库蚊抗性品系涉及的抗性机理及其特点

抗性品系抗性机理遗传特点

马拉硫磷（RM）羧酸酯酶活性提高（26倍）单因子敌百虫(RD)表皮穿透作用降低，酯酶量增高，螯合作用(sequestration)双因子氰戊菊酯酯酶活性增高；P450s；Kdr多因子

（RF）5.研究进展淡色库蚊抗性品系涉及的抗性机理及其特点

马拉硫磷（RM）55抗性治理策略的验证

运用增效剂杀虫剂的轮用杀虫剂的混用

镶嵌式防治

5.研究进展抗性治理策略的验证5.研究进展56

抗性模型昆虫在模拟试验中的运用

模拟试验模式简图5.研究进展抗性模型昆虫在模拟试验中的运用模57运用增效剂用马拉硫磷及其与增效剂IBP混用逐代处理后对马拉硫磷抗性的变化5.研究进展运用增效剂用马拉硫磷及其与增效剂IBP混用逐代处理5.研究58用马拉硫磷及其与增效剂IBP混用逐代处理后羧

酸酯酶活性的变化（A为幼虫，B为雌成蚊）

5.研究进展用马拉硫磷及其与增效剂IBP混用逐代处理后羧5.研究进展59杀虫剂的轮用与混用马拉硫磷和敌百虫轮用和混用对抗性的影响

A对马拉硫磷的抗性演化B对敌百虫抗性的演化

5.研究进展杀虫剂的轮用与混用马拉硫磷和敌百虫轮用和混用对抗性的影响5.60镶嵌式防治5.研究进展以马拉硫磷和氰戊菊酯作镶嵌式防治模拟处理的示意图

镶嵌式防治5.研究进展以马拉硫磷和氰戊菊酯作镶嵌式61以马拉硫磷和氰戊菊酯镶嵌式模拟处理后的抗性演化A：对马拉硫磷的抗性演化。B：对氰戊菊酯的抗性演化。Rm为以马拉硫磷逐代汰选的品系；Rmf为以马拉硫磷和氰戊菊酯镶嵌式汰选的亚品系;Rf为以氰戊菊酯逐代汰选的品系。

5.研究进展以马拉硫磷和氰戊菊酯镶嵌式模拟处理后的抗性演化5.研究进展626.展望抗性监测(早期诊断)抗性基因的调控和基因治疗的研究研究抗性媒介害虫与疾病的关系根据抗性变构的靶标进行生物合理设计,研制反抗性化合物6.展望抗性监测(早期诊断)63Thankyouforyourattention!!Thankyouforyourattention!!64昆虫抗性监测与治理唐振华中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所昆虫抗性监测与治理唐振华65内容昆虫抗药性及其现况抗药性机理及其分子基础抗性早期诊断技术抗性治理策略我们在该领域的研究进展展望内容昆虫抗药性及其现况66抗药性

昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力在其群体中发展起来的现象。也就是说，在多次使用药剂后，害虫对某种药剂的抗药力较原来正常情况下有明显增加的现象，其特点是这种由使用药剂而增大的抗药力，是可以遗传的。有些昆虫对某些杀虫剂表现一种天然的敏感度低，即具有高度耐受性，我们把这种先天性的抗药能力称为自然抗性(natureresistance)1.昆虫抗药性及其现况抗药性昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力67交互抗性

昆虫对一种药剂发生抗性后往往对其它没有使用过的药剂也发生抗性，这叫做“交互抗性”(crossresistance)。一般来讲，作用机理机同的杀虫剂易产生交互抗性。因为产生交互抗性的原因主要是由某些杀虫剂的作用机理或代谢机理类同所致。也就是说，由于其抗性机理相同可对不同杀虫剂产生交互抗性。1.昆虫抗药性及其现况交互抗性昆虫对一种药剂发生抗性后往往对其它没有使68负交互抗性

负交互抗性(negativecrossresistance)是指昆虫对一种杀虫剂发生抗性后对另一种杀虫剂的敏感度反而上升的现象。1.昆虫抗药性及其现况负交互抗性负交互抗性(negativecros69多种抗性

多种抗性(multipleresistance)指昆虫对同时使用的几种杀虫剂产生抗性的现象，但这种抗性对几种杀虫剂的保护机制是不同的，切勿与交互抗性相混淆。区别这两种抗性是很重要的，因为一个特殊的交互抗性型常能提供与抗性机制有关的信息。1.昆虫抗药性及其现况多种抗性多种抗性(multipleresist70抗性发展的现况

据不完全统计至2003年，已报道对杀虫剂和杀螨剂产生抗性的昆虫和螨有548种，抗性虫种分布于15个不同的目：蜱螨目、蛛形目、鞘翅目、革翅目、双翅目、蝣目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、脉翅目、直翅目、虱目、蚤目和缨翅目，其中最多的是双翅目、蜱螨类、鳞翅目、鞘翅目和同翅目昆虫，这5个目的抗性虫种约占全部抗性虫种的90%以上。其中对杀虫剂和杀螨剂产生抗性最多的虫种是蝇、蚊，其次为螨、蜱、蝶，蛾、甲虫和半翅目昆虫(包括蚜虫、蝉、叶蝉、飞虱、介虫和粉虱)。自20世纪60年代发现害虫和害螨的抗药性以来，具有抗性药性的害虫和害螨种类数量在不断地增加，特别是在70年代以后，20世纪昆虫和螨类产生抗性的情况见下图1.昆虫抗药性及其现况抗性发展的现况据不完全统计至2003年，已报道对71

抗性事例数(虫种化合物)

昆虫和螨的种类数

杀虫剂和杀螨剂化合物数

在昆虫和螨中报告产生抗性的增长情况

1.昆虫抗药性及其现况

抗性事例数(虫种化合物)

昆虫和螨的种类数

杀虫剂和杀螨72orderNumberofresistantspeciesPercentoftotalnumberofresistantspecies（548）Diptera

18434Acari8315Lepidoptera8215Coleptera7313Homoptera5811total48088

Mostresistantarthropodorderstoinsecticidesoracaricides1.昆虫抗药性及其现况orderNumberofresistantspeci73Mostresistantarthropodspeciestoinsecticidesoracaricides

SpeciesNumberofpesticides

Tetranychusurticae72Plutellaxylostella69Myzuspersicae68Boophilusmicroplus41Leptinotarsadecemlineata40Panonychusulmi40Blattellagermanica39Heliothisvirescens37Muscadomestica36Triboliumcastaneum341.昆虫抗药性及其现况Mostresistantarthropodspeci74

杀虫剂的作用及抗性机理

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示杀虫剂抗性的主要机理

2.抗药性机理及其分子基础杀虫剂的作用及抗性机理2.抗75昆虫应用的各种反应，具有代谢各种有机化合物的能力。它们的代谢物通常具有更大的亲水性(一般低毒或无毒)，这样易于排出体外。许多抗性昆虫抵抗杀虫剂的能力明显增加，加速代谢杀虫剂，使这些杀虫剂变为无毒或低毒化合物，从而使杀虫剂无法到达作用部位，由此而产生的抗性称为代谢抗性(metabolicresistance)这是昆虫的一种重要抗性机理。这类代谢能力增高是由于解毒酶的上调节(up-regulation)所致。这种上调节的增加可由细胞色素P450s和/或GSTs的转录过表达，或由水解酶基因的扩增所致。

代谢抗性2.抗药性机理及其分子基础昆虫应用的各种反应，具有代谢各种有机化合物的能力。它76代谢抗性相关的三大酶系酯酶（Est）P450单加氧酶(P450s)，又称多功能氧化酶(MFOs)谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)2.抗药性机理及其分子基础代谢抗性相关的三大酶系酯酶（Est）2.抗药性机理及其分子77代谢抗性的分子机理尖音库蚊(Culexpipiens)对有机磷杀虫剂的抗性主要涉及3个等位基因，其中2个基因座为Est-2(或酯酶B)和Est-3(或酯酶A)，它们是编码解毒羧酸酯的水解酶的酯酶基因，赋予酯酶过量产生的抗性等位基因。至今在酯酶B基因座发现有6个不同的同种异酶(allozymes)：B1、B2、B4、B5、B6和B7；在酯酶A基因座有4个不同的同种异酶：A1、A2、A4和A5。这2个酯酶基因座是紧密连锁的，之间由2~6kb的基因间隔的DNA片段把它们分隔开。同种异酶是指相同基因位点上不同等位基因所编码的不同形式的酶。第三个基因座是Ace1，编码乙酰胆碱酯酶，是一个敏感度降低（不敏感）的等位基因。2.抗药性机理及其分子基础代谢抗性的分子机理尖音库蚊(Cule78

与杀虫剂的结合能力的增加,从而减少到达靶标部位杀虫剂的量加速杀虫剂的代谢。抗性昆虫中的酯酶量的改变2.抗药性机理及其分子基础与杀虫剂的结合能力的增加,抗性昆虫中的酯酶量的改变2.79酯酶的过量的分子机理酯酶的过量产生是由2种独立的机理引起的。第一种机理是基因扩增，既可是酯酶B基因座扩增，又可是酯酶A基因座扩增，在某些情况下还可是酯酶A和B基因座一起扩增。后者是2个酯酶基因座共扩增(co-amplification)。

第二种机理为基因调节(generegulation)，用以解释酯酶A1的过量产生。但是，除了基因扩增外，还有基因调节可贡献于其他变异体的过量产生。

2.抗药性机理及其分子基础酯酶的过量的分子机理酯酶的过量产生是由2种独立的机理引起的。80抗性昆虫中的酯酶质的改变

与有机磷抗性相关的酯酶除了量的变化外，还存在质的变化。这种质的变化的基础可能涉及酯酶的结构改变，从而增加其降解杀虫剂的能力例如:家蝇和铜绿蝇中色氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)2.抗药性机理及其分子基础抗性昆虫中的酯酶质的改变与有机磷抗性相关的酯酶除了81在抗性昆虫中P450的过表达抗性虫种(品系)过表达的P450参考文献抗性家蝇(Rutgers)CYP6A1Carino等，1992；1994。抗性家蝇(LeranPyrR)CYP6D1Scott等，1996。

抗性果蝇CYP6A2Waters等,1992;Brun等,1996。抗性果蝇CYP6A9Maitra等，1996。

抗性棉铃虫CYPB2Xiao-Ping和Hobbs,1995。吴峻等，1999。抗性烟芽夜蛾CYP4G8Pittendrigh等,1997。

CYP9A1Rose等，1997。2.抗药性机理及其分子基础在抗性昆虫中P450的过表达抗性虫种(品系)82抗性昆虫中GST酶量的改变基因扩增基因转录速率加快尚未发现GST酶的质的改变2.抗药性机理及其分子基础抗性昆虫中GST酶量的改变基因扩增2.抗药性机理及其分子基83靶标抗性

靶标敏感度降低是昆虫产生靶标抗性的第二种主要机理。一般来讲，杀虫剂进入昆虫体内经活化，或未被代谢的杀虫剂与靶标分子、靶标蛋白结合互相作用，改变其功能，结果产生中毒症状，最后死亡。由于抗性昆虫的靶标分子发生了变化，从而降低其与毒剂的结合作用，或降低与杀虫剂的作用，这种因敏感性降低而产生的抗性。称为靶标部位抗性(或靶标抗性)(target-siteresistance)。

2.抗药性机理及其分子基础靶标抗性靶标敏感度降低是昆虫产生靶标抗性的第二种84杀虫剂作用的主要靶标有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标

乙酰胆碱酯酶(AChE)滴滴涕和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标

钠离子通道环戊二烯类杀虫剂的作用靶标

-氨基丁酸(GABA)受体氯离子通道

2.抗药性机理及其分子基础杀虫剂作用的主要靶标有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标85靶标抗性的分子机理乙酰胆碱酯酶敏感度降低(InsensitiveAChE)GABA受体突变(GABAreceptormutation)电压门控钠离子通道突变(mutationsinthevoltage-gatedsodiumchannel)2.抗药性机理及其分子基础靶标抗性的分子机理乙酰胆碱酯酶敏感度降低(Insensiti86

品系115199303368位置

SaltilloSerValAlaTyr突变

BygdeaPheValAlaPhePierrefeuPheThrAlaPheMH19PheIleGlyTyrSensitivePheIleGlyPhe

果蝇AChE基因（Ace中的抗性突变）2.抗药性机理及其分子基础乙酰胆碱酯酶敏感度降低

87

家蝇抗性品系中发现的氨基酸点突变

抗性品系突变位点49R G365ACH2 G262AF327Y77M V180L G262A F327Y690ab G262V F327YCT V180L G262A F327YYBOL

V180L G262V F327YSH-PR V180LG262V F327YD422V

2.抗药性机理及其分子基础家蝇抗性品系中发现的氨基酸点突变2.抗药性机理及其分子基88抗性比抗性比果蝇单个和组合突变(以单字母氨基酸符号表示)对AChE抗性的影响

2.抗药性机理及其分子基础抗性比抗性比果蝇单个和组合突变(以单字母氨基酸符号表示)对A89

AChE敏感度降低的埃及伊蚊Ace基因的定向突变

2.抗药性机理及其分子基础

2.抗药性机理及其分子基础90GABA受体突变(GABAreceptormutation)

RDLGABA受体亚基的四个跨膜区（黑色矩形）和保守的半胱氨酸桥（C=C），将每二个跨膜区（M2）放大可见抗性突变位点S丙氨酸(Aly)丝氨酸(Ser)2.抗药性机理及其分子基础GABA受体突变(GABAreceptormutatio91电压门控钠离子通道突变

钠通道结构的模式图[(a)根据表25.6中所列文献；图(b)、(c)仿Vais等(2001)修改]a表示多种昆虫与kdr抗性相关的突点位置[图中编码是根据家蝇para序列(见GenBankX96668)；b表示离子孔周围跨膜螺旋片段的方向；c表示根据诱变和光亲和性标记试验所表明的部分麻醉剂(localanesthetics,LA)、双鞭甲藻毒素(brevetoxin,pbTx)和拟除虫菊酯(pyrethroids,Py)与S5和S6片段结合部位位置的放大示意图。

2.抗药性机理及其分子基础电压门控钠离子通道突变92医昆kdr型抗性涉及的突变及其在Na+通道中的部位结构域kdr突变部位虫种文献结构域ⅠS4-S5内环

I253VDmLee和Soderlund(2001)N端(ⅠS6-ⅡS1

接头)的ⅠS6处D58GBgLiu等(2000)近ⅠS6处

E4334KBg

Liu等(2000)近ⅡS1处

C764RBg

Liu等(2000)结构域Ⅱ

S6L1014FMdWilliamson等(1996)S6L1014FHiGuerrero等(1997)S6L1014FAgMartinez-Torres等(1998)S6L1014FCpMartinez-Torres等(1999b)

S6L1014SCpMartiney-Torres等(1999b)

AgRanson等(2000)

S6L1029HHvPark等(2000)S4-S5内环

M918T*MdWilliamson等(1996)

HiGuerrero等(1997)PcLee等(2000)

S6L993FBgDong等(1997);Liu等(2000)2.抗药性机理及其分子基础医昆kdr型抗性涉及的突变及其在Na+通道中的部位2.抗药93结构域Ⅲ

S6M1524IDmLee和Soderlund(2001)S6M1536IDmDoyle等(1998)S6F1550IBmPittendrigh等(1997);He等(1999)S5-S6A1494VDmPittendrigh等(1997)S5-S6V1410ADmPittendrigh等(1997)ⅢⅣ5´端

结构域ⅣS65´端P1880IBgLiu等(2000)Dm：黑腹果蝇(D.melanogaster)Md：

家蝇(M.domestica)

Cp：尖音库蚊(C.pipiens)Ag：冈比亚按蚊(A.gambiae)Bg：德国小蠊(B.germanica)Hi：搔扰角蝇(H.irritans)Pc：头虱(P.capitis)Bm：微小牛蜱(B.microplus)*super-kdr突变

结构域kdr突变部位虫种文献2.抗药性机理及其分子基础结构域Ⅲ结构域k94抗性早期诊断技术

在通常情况下，在田间防治失效时，抗性已是比较高了，只能换用无交互抗性的杀虫剂。抗性治理只有在抗性基因频率较低时才有效，所以必须对抗性种群进行抗性监测。

3.抗性早期诊断技术抗性早期诊断技术在通常情况下，在田间防治失效时，95区分剂量（discriminatingdosage）

技术首先获得该虫种的SS个体，即敏感纯合子品系，对某种杀虫剂的敏感度基线(base-linedata)，然后用该品系的LC99.9(或LD99.9)的剂量处理，存活的个体即为RS和RR个体。该方法的缺点是：①要通过遗传杂交的方法来纯化品系，较繁琐、费时；②难以真正完全区分RS和RR个体；若RS呈隐性，则无法将SS和RS分开；③无法了解其抗性机理。3.抗性早期诊断技术区分剂量（discriminatingdosage）

技术96

F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分离情况“a”具有典型的1:1分离，“b”没有明显的诊断剂量3.抗性早期诊断技术F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分离情况397

基于酯酶的测定方法(1)

应用高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)测定单个蚊虫的酯酶活性。酯酶水解模型底物-醋酸萘酯为醋酸和-萘酚，后者与染料固蓝盐B反应生成一种蓝紫色物质(λ=550~600nm)，用分光光度测定，以其光密度为酯酶活性。Pasteur和Georghiou（1989）根据这个原理，发展了测定单个昆虫的酯酶滤纸快速测定法。即取单个昆虫匀浆液（磷酸缓冲液）少许，点滴于滤纸上（在此滤纸为携酶的载体），然后浸入含有-­醋酸萘酯（底物）的磷酸缓冲液1min后取出，再浸入含有显色剂的染色液，晾干后对色斑的大小和强度进行测定和比较。

3.抗性早期诊断技术

基于酯酶的测定方法(1)

应用高效液相层析(h98

微量滴度酶标板法（microtiterplateassay）测定了单个烟芽夜蛾幼虫的酯酶活性。测定底物为以对硝基苯乙酸(p-nitrophenylacetate,PNPA)。酶液制备：取单个幼虫