《实验瑶山树鼩第2部分：微生物学等级及监测》征求意见稿

《实验动物瑶山树鼩第2部分：微生物学等级及监测》（征求意见稿）编制说明《实验动物瑶山树鼩第2部分：微生物学等级及监测》专业标准编制组二0二二年三月工作简况（一）任务来源与项目编号为规范和统一实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测的具体操作，建立实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测技术规范，结合目前尚无实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测国家标准及地方标准，有必要制定实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测地方标准。本标准由广西壮族自治区市场监督管理局下达的2021年第二批广西地方标准制修订项目：《实验动物瑶山树鼩第2部分：微生物学等级及监测》（序号：2021-2014）。（二）主要起草单位本标准由广西中医药大学负责起草完成。（三）主要起草人员名单主要起草人员名单如下：研制人员姓名职务/职称专业所在单位项目负责人唐海波副研究员预防兽医学广西中医药大学主要参加人员冷静教授免疫学广西中医药大学梁亮工程师微生物学广西中医药大学运晨霞教授免疫学广西中医药大学黄正团高级实验师动物学广西中医药大学张丽峰副教授免疫学广西中医药大学肖健教授免疫学广西中医药大学曹颖颖助理研究员预防兽医学广西中医药大学杨庆利研究员免疫学广西中医药大学二、编制标准意义面对发达国家巨大的资源优势，实验动物资源的缺乏和多样性的不足，已成为制约我国生命科学研究与应用的瓶颈之一。许多生命科学研究与应用因无理想的实验动物无法进行，只有加强资源开发的力度，才能为我国生命科学的发展提供长期的技术支撑。树鼩目前划归为攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)树鼩属。属于国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物。从解剖学分析，树鼩的免疫系统、内分泌系统和神经系统的组织形态特征与灵长类高度相似。滇西树鼩全基因组测序已完成，通过与多个物种基因组比较分析进一步证实了树鼩与灵长类亲缘关系最为接近。树鼩与人类在生理机能、生化代谢和基因组等方面的相似性远高于大鼠、小鼠、土拨鼠等常用啮齿类实验动物。树鼩的许多分子和细胞结构近似人类，同时树鼩具有个体小，易于操作，性成熟时间比较短，饲养方法简单且繁殖较快，价格相对便宜等优点。此外树鼩已被证实可感染多种人类相关病毒，包括EB病毒、乙肝病毒及丙型肝炎病毒等。因此树鼩有望代替灵长类动物作为某些人类重大疾病研究的动物模型，具有广泛的应用前景。瑶山亚种（T.b.yaoshanensis）是广西的一个特色物种资源，主要分布在广西金秀，是具有重要开发潜力的实验动物。瑶山亚种树鼩属于树鼩的一个亚种，目前没有关于瑶山树鼩微生物学等级及监测方面的标准，本项目初步解决了瑶山亚种树鼩的质量控制和疾病防治，实现实验树鼩规范化繁殖生产控制管理，可以提供健康标准的实验树鼩及实验室，满足广西实验瑶山亚种树鼩资源发展及应用实验的需求，也为瑶山亚种树鼩资源保存和应用提高有力的保证，制定本标准十分必要。三、标准编制及研究起草过程（一）标准前期工作2013年以来课题先后承担相关课题：广西科研条件建设与开发利用研究课题《广西瑶山亚种树鼩资源实验动物化研究与开发基地》（编号：广西科技基础条件平台建设14-91-03）；《广西瑶山亚种树鼩近交系培育和实验动物化的研究》（编号:桂科攻1347003-6）。课题开展了广西瑶山亚种树鼩实验动物化培育及种质资源基地基础建设：建立规范化实验树鼩饲养繁殖设施、设备，研究实验瑶山亚种树鼩实验动物化和资源保存技术和方法，建立资源基地。（二）标准研究过程广西瑶山亚种树鼩资源实验动物化研究与开发基地立项建设以来，课题组收集整理本基地及国内外已有实验树鼩质量标准、技术规程和相关技术资料。研究分析国内外各类标准制定的背景、指导原则、动物等级划分和质量控制参数设置的依据，研究分析我国发布执行的地方标准与现行实验动物国家标准架构上的异同点，分析比较国内国外标准和相关规程对实验树鼩质量控制要求的异同点。收集整理我们基地及我国实验树鼩已有研究成果，到实验树鼩其它的生产机构和一些省市相关实验机构（如云南的中国医学科学院医学生物学研究所、中国科学院昆明动物研究所）等进行实地调研，开展广西瑶山亚种树鼩饲养管理、微生物学、寄生虫学、遗传学、病理学、配合饲料和环境条件等方面的各项指标和参数的标准化研究，为标准制定提供数据。以实验瑶山亚种树鼩的标准化为目的，综合大量基础数据并结合实际操作中质量控制方面存在的不足和近年来实验动物国家标准在执行过程中暴露出的问题，提出实验瑶山亚种树鼩标准制定思路和基本原则以及相关指标和参数的设置范畴。本课题通过收集、整理和研究，补充了影响实验树鼩质量的各种基础数据的工作基础上，确定了制定标准的指导思想和基本原则。编制小组对取得的数据进行全面整理，根据试验结果，确定了实验动物瑶山树鼩的术语和定义，规定了实验动物瑶山树鼩微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、结果判定、判定结论等。并在编制过程中咨询了内行专家，对收到的反馈意见进行分析、采纳、修改，形成了本标准的研究稿。四、标准立项后到目前的工作进展情况《实验动物瑶山树鼩第2部分：微生物学等级及监测》于2021年10月立项进行制定，按照《广西壮族自治区地方标准管理规定》要求，课题组2021年10月26日，确定广西中医药大学副校长冷静教授为编制组的总负责人，同时成立了标准编制小组，进行了任务分工。并对本标准的研究稿反复研究讨论，检阅查新国内外的相关标准更新情况，并咨询了正在主持修订《实验动物微生物寄生虫学等级及监测》国家标准的魏强研究员（中国医学科学院医学实验动物研究所）相关的实验动物等级分类及检测病原更新与修改情况，魏强研究员提供了正准备发布国标，新的国标取消了清洁级动物分类；修订了各等级动物的概念；调整了必须检测项目和必要时检测项目，检测动物病原体项目主要包括3类：动物烈性病原体、人兽共患病病原体和对动物实验干扰大的病原体。具体的内容如：豚鼠、地鼠和兔细菌项目中删除了小肠结肠炎耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）、皮肤病原真菌(Pathogenicdermalfungi)和念珠状链杆菌（Streptobacillusmoniliformis）。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa调整为必要时检测项目。小鼠、大鼠细菌项目中删除了假结核耶尔森菌（Yersiniapseudotuberculosis）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）、皮肤病原真菌(Pathogenicdermalfungi)的检测项目。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa调整为必要时检测项目。大肠埃希菌(O115a,C,K(B)EscherichiacoliO115a,C,K(B))变更为啮齿柠檬酸杆菌（Citrobacterrodentium）等最新的资料信息，课题组认真思考后，做了对应的修改与完善并形成了本标准的征求意见稿，并讨论优选了10名国内均为正高级的优秀专家作为征求意见的对象，目前已发给或准备发给国内的相关专家进行函审。共得的10位专家的积极回应，答应帮忙审阅，征集专家意见正在顺利推进中。五、意见征集情况及修改说明准备开始。六、标准审订情况尚未开始。七、标准编写原则及确定标准内容的论据（一）标准编写原则1.遵循《中华人民共和国标准化法》等法规和标准。2.本标准的格式和编写方法执行GB/T1.1-2009的规定。3.本标准的制定力求准确、系统，内容与当前云南省滇西树鼩的微生物学等级及监测地方标准紧密结合，同时根据瑶山树鼩实际差异，对微生物学等级及监测中存在的问题进行修订与改善，重视实际可操作性。（二）标准编写依据1.制定本标准的目的是规范和统一实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测的具体操作，建立广西瑶山亚种树鼩资源基地。2.本标准的编写以实验动物瑶山树鼩微生物学等级及监测的高效性、安全性生产高质量的实验动物瑶山树鼩为基本依据。八、标准主要技术内容(一)范围本标准列出了实验动物瑶山树鼩微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、结果判定、判定结论。（二）规范性引用文件GB19489实验室生物安全通用要求GB/T14926.1实验动物沙门菌的检测方法GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.11实验动物大肠埃希菌O115a,c:K(B)检测方法GB/T14926.13实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB/T14926.15实验动物肺炎链球菌检测方法GB/T14926.16实验动物乙型溶血性链球菌检测方法GB/T14926.17实验动物绿脓杆菌检测方法GB/T14926.30实验动物兔轮状病毒检测方法GB/T14926.47实验动物志贺菌检测方法T/CALAS8-2017实验动物 树鼩微生物学等级及监测（三）主要技术内容及其说明1.野生瑶山亚种树鼩来源：野生瑶山亚种树鼩来源于产地-广西金秀大瑶山。瑶山亚种树鼩生活习性：瑶山亚种树鼩的外形非常像松鼠，善于攀缘树木，行动很敏捷。多活动于山地、平原谷地的森林或林缘灌木林地区，也可见于村寨附近的灌丛。树鼩食性杂，以昆虫为主食，其次是小型哺乳动物和甜果。清晨和傍晚是树鼩觅食的高潮期，进食时，它们都会用前面的双爪子抓住食物啃食，同时发出清脆、快速的嗒吱声，进食后常常舔舐双爪，表现出类似“洗脸”和“洗手”的动作。树鼩体内的分泌的尿液、唾液含有的气味在领土行为上发挥着重要的作用，雄树鼩的体液物质以及领土行为是由雄激素所产生控制的。缩小生活空间、增加同性别个体数量可使树鼩应激性增强而发生角斗，导致使其体重下降，雄性树鼩会出现性行为减退，血象、骨髓象各类细胞均升高。树鼩易受惊，对环境非常敏感的动物，外界环境发生刺激，树鼩即刻处于高度紧张状态。如果这种紧张状态延续时，树鼩体重会减轻，臭腺发育不正常，雄性个体的睾丸会缩小，睾丸位置也会发生改变，甚至因衰竭而死亡。处于妊娠阶段的雌性树鼩如果受到过度惊吓，会引起流产、早产、难产。如果哺乳阶段的雌性树鼩受到惊吓，则极有可能造成乳腺分泌上的障碍，或拒绝哺乳，甚至因臭腺功能的丧失而咬食仔树鼩。野生瑶山亚种树鼩实验室驯化饲养笼：不锈钢树鼩笼（380*260*300mm），每笼后面带PVC休息箱（200*100*140mm），四层冲洗式（4*5套笼）。实验室饲养环境：普通开放环境动物房，装有空调和排风扇，房间备用除湿机。控制环境条件：成年瑶山树鼩饲养室内温度控制在15～25℃，室内湿度控制在45～70%。天晴时可将窗口打开但必须确保纱窗关闭；若阴天则采用风机进行间断性通风；晚上关闭。每天150w日光灯人工光照12h（7:30～19:30）。室内禁止任何人为的响动，开关门必须最大限度的减少噪音。饲养员在室内手机调为振动并且禁止接听和拨打。注意观察记录树鼩饲养房内的温度、湿度、通风情况、氨浓度变化及饲养密度等。4.1日常卫生管理盛料槽必须保证清洁卫生无污染而且用优氯净液浸泡清洗（2~3次/周）。苹果用高锰酸钾液或优氯净液浸泡10分钟后清洗干净，切块饲喂。每次喂饲料前将剩余饲料倒出，加入新料（同时做食欲记录）；苹果饲喂后若有剩余须捡出。每天早上清扫粪便完成后饲喂；至少每周对地面进行喷雾消毒一次；每月对饲养房进行彻底消毒一次。4.2树鼩饲养笼的清洗消毒饲养人员每个月逐一对饲养笼至少进行1次彻底的清洗消毒，在整个过程中饲养人员必须穿戴好工作服、帽子、口罩、橡胶手套、深筒水靴以及防水衣。将瑶山树鼩转移至清洗消毒好的饲养笼。工作人员相互配合将饲养笼取下并转移至清洗消毒室。对饲养笼进行无死角的清洗。清洗完毕后将饲养笼放入消毒池浸泡30分钟以上。消毒液的配制：84消毒液按2%浓度配比后浸泡饲养笼，过氧乙酸液0.5%浓度配比后浸泡饲养笼。饲养笼浸泡后再次用清水彻底清洗。最后将饲养笼放至储存间备用。饲养架于房间内用抹布擦洗干净后用三氯异氰尿酸按1:1000～1:2000的浓度进行喷雾消毒。4.3筛选基础种群瑶山亚种种树鼩选择体况好无伤残，被毛光亮，母树鼩乳头大且均匀，公树鼩睾丸明显，另外还要注意不选择有下列情况的树鼩作为种用：被毛脏乱、无光泽或脱毛的树鼩；雌树鼩体况过于消瘦或肥胖，体重偏离正常范围（160g~210g）的母树鼩；骨盆腔狭窄的母树鼩；雄树鼩阴茎过短或隐睾的公树鼩。4.4瑶山亚种种树鼩基础种群细菌控制指标检测为了解瑶山亚种种树鼩基础种群质量情况，我们委托广西疾病预防控制中心（广西具有实验动物质量检测资质的单位）对瑶山亚种树鼩细菌携带情况进行检测，抽样6只瑶山树鼩检测，结果表明：我们的瑶山树鼩基础种群不携带有沙门菌、空肠弯曲菌、绿脓杆菌、志贺菌、空形杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌，达到中国实验动物学会团体标准（T/calas8-2017）实验动物树鼩微生物学等级监测，无特定病原体（SPF）级树鼩应该排除的细菌类微生物标准。从细菌检测结果显示我们瑶山亚种种树鼩基础种群质量非常好。4.4.1瑶山亚种树鼩的常见细菌性感染从发病树鼩肝脏和肠道中分离到可疑细菌，通过形态学观察、生理生化特性测定、16SrRNA序列进化分析，鉴定分离菌株为奇异变形杆菌，与GenBank收录的猪奇异变形杆菌RBX1株亲缘关系最近。药敏试验显示，该分离菌株对红霉素、克拉霉素、奈替米星等9种药物高度敏感，对多粘菌素、恩诺沙星等3种药物中度敏感，对米诺环素、头孢氨苄、强力霉素等12种药完全耐药。耐药基因检测发现，该分离菌存在氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类耐药基因。致病性检测显示，该分离菌对成年昆明小鼠的半数致死量（LD50）为1.26×108CFU。综上研究表明，引起多次树鼩死亡的病原菌为奇异变形杆菌，且毒力较强，治疗时我们采用针对性的高敏药物。奇异变形杆菌是一种常见的人兽共患菌，也是条件致病菌，呈全球范围分布、宿主种类广泛和致病较强。从树鼩中分离得到一株树鼩源具有多重耐药的奇异变形杆菌菌株，因此加强对奇异变形杆菌及其耐药性的监测十分必要。此外课题组前期开展了瑶山树鼩粪便可培养细菌的分离与鉴定，掌握了瑶山亚种树鼩粪便菌群的多样性和潜在的致病性；同时日常饲养过程，从偶发疾病的树鼩内脏和肠道中分离到可疑细菌，通过形态学观察、生理生化特性测定、16SrRNA序列进化分析，鉴定分离多种病原微生物。包括嗜水性气单胞菌、沙门氏菌等。此外，我们开展了广西野生瑶山亚种树鼩粪便可培养细菌的分离与鉴定，结果从19只瑶山亚种树鼩粪便标本中分离得到35株细菌，经16SrRNA序列分析，共鉴定出7科13属20种细菌，广西野生瑶山亚种树鼩肠道中主要菌群包括大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌等。相关研究为掌握第一手广西野外捕获的野生瑶山亚种树鼩粪便菌群的多样性和潜在的致病性，为瑶山亚种树鼩的隔离检疫、实验室饲养及常见消化道疾病的防治提供科学依据。4.5结果与分析4.5.1瑶山亚种种树鼩基础种群的筛选瑶山亚种种树鼩基础种群的筛选是以建立瑶山亚种种树鼩封闭群为建群目标，2016年我们从野生驯化树鼩筛选出瑶山亚种种树鼩封闭群基础种群数量为152只，2017年3月抽样检测用了6只，2018年饲养过程中出现过疾病死亡11只，2019新引入61只，目前种群规模为196只（雄性90只、雌性106只），符合封闭群数量不能小于25对的要求；基础种群足够大可以有效地保持野生瑶山亚种树鼩遗传的多样性，能保存各种有价值或潜在有价值的基因，但成本投入巨大;基础种群者过小成本投入较小，但不排除有生物医学价值的性状随着基因的纯和而被剔除。因此，基础种群的大小应综合各种因素，建立最佳方案。综合以上研究，本项目解决了瑶山亚种树鼩驯养繁殖问题，筛选建立了瑶山亚种树鼩实验动物研究种群基地，初步解决了瑶山亚种树鼩的质量控制和疾病防治，实现实验树鼩规范化繁殖生产控制