分配色谱课件

大家好！第三章分配层析

第一节概述分配层析（Partitionchromtography）是基于混合物各组分在固定相与流动相之间的分配性质不同而实施分离的一种层析方法。一、术语及其涵义

在分配层析中一般用多孔物质牢固地吸附一种液膜，此液膜始终固定于多孔物质上，故称为固定相，此多孔物质称为支持物，而所用的洗脱溶剂（一般与固定相不相溶）即为流动相。不同组分在流动相与固定相之间的分配系数不同，在层析过程中迁移速度也各异，故可彼此分开。在固定相中分配系数较大的组分可在固定相内充分地扩散分配，故在此相停留的时间较长，而在流动相中停留的时间必然较短，反之亦然。三、分配层析的基本原理

1．分配系数

设S与M为完全不混溶的两种溶剂，若将某一物质X溶于S中，而后再加入M，则X的分子就会穿越两相界面扩散至M中；与此同时，扩散至M中的X分子亦可再扩散返回S中。经过一段时间，进出S与M的X分子数相同，即达到两相平衡。若用cs和cM分别表示X物质在S与M相中的浓度，用K表示X在两相中的浓度之比，则三者的关系式为：

大量实验证明，在温度、压力和两相系统都一定的条件下，一种物质在两相中分配达到平衡时，它在两相中的浓度之比为常数，此常数即分配系数K这就是分配定律，它是分配层析的理论基础。分配系数的大小是由物质与两相溶剂的热力学性质决定的，与温度密切相关，但与两相体积无关：当层析体系和分离物质给定以后，分配系数仅与温度有关示：2．塔板理论

Martin等人沿用精馏塔中塔板的概念来描述分配层析过程中组分在两相中的分配行为，并引用理论塔板数作为衡量分配层析分离效率的指标．在此基础上提出了塔板理论，为了方便起见，先对塔板理论作如下理想的假设：①分配层析柱由完全相同的不连续的“理论塔板”组成：一定条件下，层析柱的理论塔板数是恒定的。②层析体系中待分离混合物各组分之间的相互影响忽略不计；③塔板的空间由固定相和流动相占据，流动相所占据的空间称为塔板体积（△VM）。④层析体系的分配系数与组分浓度大小无关，都为常数，色谱峰呈高斯分布；⑤待分离物质在每一塔板中只存在横向扩散，没有纵向扩散，并在两相中瞬时达到平衡。有效塔板数（N）：

塔板高度相当于一块塔板所占有的柱长。对于给定的层析体系，塔板数越多，高度越小，柱效越高，用塔板高度表示柱效会更明确，因为H与层析住柱长无关长为L，n与H及n与He（有效塔板高度）之间存在下列关系：3．分离的实现分配层析中，由于待分离混合物中各组分性质不同，在固定相与流动相中的溶解能力不同，所以它们的分配系数存在差异。K值小的组分在固定相上溶解能力差，在固定相中停留的时间短，在柱内移动速度快，因而先流出层析柱；反之，K值大的组分后流出层析柱。这样，由于分配系数的差异，造成各组分在柱内的移动速率不等，即差速移行，经过一定柱长后，各组分就会先后流出层析柱而获得分离。2．优点

近年来液滴逆流层析广泛用于分离纯化皂苷、生物碱、有机酸、蛋白质、多肽、糖类等，与其他层技术相比它具有如下优点：①液液滴逆流层析不以固体作为固定相的支持物，避免了固体支持物（如硅胶、氧化铝等对分离物质为不可逆吸附；同时，还避免了由固体支持物所引起的表面化学反应；②在分离的过程中，待分离样品不与空气相接触，因而样品不会氧化；

③在一般层析过程中，用某些溶剂，尤其是大极性溶剂洗脱往往会将支持物中的杂质溶出，污染样品。液滴逆流层析则可以克服这一缺点。④一般层析方法所存在的色谱峰畸形拖尾的现象在液滴逆流层析中得到了改善或完全避免。⑤液滴逆流层析虽然亦使用玻璃材料，但装置固定，操作中不需要震荡，因而不易损坏；且因为无震荡过程，不易乳化或产生泡沫，利于分离。

⑥因为不存在吸附等因素，在液滴逆流层析中可以定量回收样品。⑦液滴逆流层析在重现性上明显优于一般层析方法。

近几年的实践也证明了液滴逆流层析法在植物成分的分离纯化与分析方面不失为一种较为适用的技术，是一种操作简便、条件温和的层析方法。3．液滴逆流层析的新发展

ItoY.在液滴逆流层析的基础上提出了高速逆流层析（highspeedcountercurrentchromatography，简称HSCCC），原理类似于液滴逆流层析它依靠高速行星式旋转产生的离心力使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管中，并使流动相单向、低速地通过固定相，从而实现对样品的连续分离。二、装置

液滴逆流层析装置主要由进液部分、分离部分和输出部分组成

1．进液部分这一部分由流动相储液槽、微型泵及进样器三部分组成流动相通过微型泵注入层析管。2．分离部分

分离部分由内径2mm左右，长20-40cm，以玻璃管、四氟乙烯管或金属管制成的分配萃取管100-1000根连接而成，相互之间以内径0.5mm的四氟乙烯输液管相连接若以四氟乙烯管作分配萃取管，则因为与输液管之间不易紧密连接，因而当分配萃取管数目过多，压力升高时，易发生漏液现象，所以四氟乙烯管数目多以100根为限。若以玻璃管作分配萃取管，因玻璃质地坚密，与输液管之间可以紧密连接，不易漏液，分配萃取管数目可以酌情增加。3.输出部分

输出部分由检侧器及分部收集器组成。液滴逆流层析根据移动相流动方向的不同可以分为上升法与下降法。将移动相与固定相充分摇匀平衡，而后任意选择上层或下层为固定相液。上升法选择下层为固定相，上层为移动相，移动相由下端进入分配萃取管形成液滴后上行；下降法选择上层为固定相，下层为移动相，移动相由上端进入分配萃取管形成液滴后下。如使用四氟乙烯管作为分配萃取管，因移动相下行时只能沿管壁下行，所以不能用于下降法，只能用于上升法。玻璃分配萃取管两种方法都可采用，若内壁涂以硅油，则更利于形成液滴。

上升法的操作程序是：先将固定相液充满分配萃取管，移动相由微型泵由下端输入管中，形成液滴；由于移动相的比重比固定相小，故它在固定相中逐渐上升至分配萃取管顶端；微型泵继续加压送液．使移动相通过输液管进入下一根分配萃取管的下端，再次形成液滴并在固定相中逐渐上升；这一过程不断地在下一根分配萃取管中重复，直至输出分配萃取管并被分部收集器收集。下降法的操作与之相似，只是移动相由上端进入分配萃取管。2．液滴的移动速度

液滴在分配萃取管中移动的速度与两相溶剂的比重差及溶剂与管壁的摩擦力有关。两相的比重相差越大，与管壁的摩擦力越小，液滴移动速度越快，反之亦然。

3．液滴的间隔液滴的间隔取决于微型泵输送移动相的速度。输送速度越慢，液滴间隔越长，所需层析时间也越长，反之亦然。虽然可通过加快输送速度来缩短液滴间隔，从而缩短层析时间，但输送速度过快、间隔过小（甚至形成线流）会影响待分溶质的充分分配而不能保证有较理想的分离效果。第三节反相层析

一、概述1．反相层析的涵义

混合物的分离主要取决于各组分与流动相及固定相之间的相互作用，该相互作用可用它们的分子极性来量度固定相和流动相的极性都会对分离效果产生决定性的影响；通常把固定相极性大于流动相极性的色谱方法称为正相层析（通常所说的“层析”多指正相层析）。而将固定相极性小于流动相极性的色谱方法称为反相层析，反相层析的固定相一般是采用化学键合的非极性固定相，流动相多为水、乙腈、甲醇等强极性溶剂。2．反相层析的特点反相层析己成为现代液相色谱中普遍采用的技术，广泛应用于植物成分的分离分析。反相层析具有以下特点：①使用方便，柱寿命较长，溶剂较为便宜。②其非极性固定相表面作用较弱，柱平衡所需时间相对较短。

③极性小于溶剂的样品能够在反相色谱柱头处浓缩，使分离条带更为清晰。④利用离子对试剂可在流动相中形成离子对的原理，反相层析可用来分离离子型化合物。⑤允许样品有较大的极性和相对分子质量范围，在蛋白质、多肽、核糖核酸、脱氧核糖核酸的分离分析上具有独特的优越性。该理论描述：

极性溶剂中的非极性相互作用。当非极性溶质或溶质非极性部分在极性溶剂中时，能相互产生排斥力，使非极性部分的取向在极性溶剂中形成空腔，空腔的形成和大小成和大小与溶剂性质和溶质表面积及偶极矩有关。Horvath认为溶质与溶剂间的疏水作用“迫使”溶质与非极性配位体之间形成络合物或缔合物，意即溶质在柱上保留不是因为溶质与非极性配位体间的非极性相互作用，而是因为溶质受到极性溶剂排斥力作用而产生溶质与配体之间的疏溶剂缔合，缔合强度取决于溶质分子中非极性部分的总表面积、非极性配体的总表面积和流动相的表面张力等。疏溶剂理论的示意图

除了疏溶剂效应外，实际上在含水量不高时，固定相表面残余硅醇基能够与溶质阳离子或成氢键基团相互作用，也对溶质保留有着重要的影响。所以在反相色谱中，溶质保留行为受到疏溶剂作用和亲硅醇作用的双重影响，被称为“双保留原理”。双保留原理的作用经常导致在色谱分离中出现保留值重现性差、色谱峰拖尾等现象。出现此类现象时，一般要在流动相中加入适当的改性剂来消除硅醇基的影响。三、反相色谱的填料

反相色谱的填料多是以微粒多孔硅胶为基质制备的键合相载体，各种硅胶的粒径、形状、孔径、表面积都可在制备过程中控制。然后再以硅烷化试剂与硅胶表面大量存在的硅醇基进行键合反应。早期采用烷基三氯甲硅烷作为硅烷化试剂，目前一般用烷基二甲基氯甲硅烷。由于立体效应及其他因素的影响，硅胶表面约有40％-50％的硅醇基不能被烷基化。近年商业上多采用两步硅烷化方法：首先用烷基二甲基氯甲硅烷作烷化剂，该试剂反应后水解时不会产生硅醇基；再用三甲基氯硅烷进行第二步烷化以充分减少残留硅醇基的数量。

硅烷化时，烃类配基多是C1-C18的烷基链，也有采用苯基或苯乙基的，较为常用的是带有十八烷基主链（C18H37）的硅胶填料，一般称之为ODS硅胶。蛋白质的反相色谱通常采用C8键合硅胶。常用商品化反相色谱填料规格和性能见表。四、反相色谱条件的选择

采用反相色谱进行样品的分离分析时，键合相及流动相的选择至关重要。表选列了一些常用键合相和流动相的适用范围。此外，在反相色谱中，尚需考虑的因素还有pH值、柱温、流速等。比如：以硅胶为基质的键合相耐受pH为2-8，实际应用一般在3-7之间，超过这个范围，填料表面容易受到酸碱的破坏，不仅严重影响分离效果，而且会大大缩短拄的使用寿命此外，柱温和流速对分离效率也有一定的影响。第四节纸层析

1944年，Consden、Gordon和Martin首次应用层析方法成功地分离了多种氨基酸，从此这种以滤纸为支持物，在一定的溶剂中展开便可达到分离目的的方法得到了广泛的应用。一、纸层析的原理

纸层析是一种以滤纸为支持物，以纸上吸附的水为固定相的分配层析方法。Rf值除与化合物自身的性质和结构有关外，溶剂系统、温度、展开方式及共存物质等其他因素也会对其产生影响。二、纸层析的操作技术

1．滤纸的选择和预处理

在一般的纸层析实验中，只要滤纸的质地均一、厚薄得当、杂质较少都可以使用定性实验需使用较薄的滤纸，而厚质滤纸（如新华5号）则多用于样品的分离制备。有些滤纸中存在较多的无机盐离子和一些有机杂质，对纸层析效果影响较大。如Ca2+和Mg2+的存在会使有机酸类物质产生拖尾现象；即使是痕量的金属离子也会与一些氨基酸及其他有机物产生络合，显色后出现复斑，影响层析效果。这些杂质可以通过预处理的方法予以去除。常用的预处理方法是：将滤纸用1mol/LHNO3溶液浸泡过夜后以去离子水洗至中性，再依次用乙醇和乙醚洗涤，干燥后备用。此外，0.01-0.4mol/L的HCl溶液、0.2％的EDTA溶液及8-羟基喹啉溶液也可用于层析滤纸的净化处理。2．展开剂的选择

纸层析中展开剂的选择主要依靠经验。可先参考结构类型相似的化合物在纸层析分离中所用的展开剂，在此基础上，再通过反复摸索来获得理想的溶剂系统二理想的展开剂应满足下列要求：

①对样品有良好的溶解性，且不与之发生化学反应。

②若采用多元溶剂体系，温度对该溶剂组成比例影响不显著；

③样品各组分在该溶剂系统中的Rf值差异较大。3．点样

将样品配制成浓度为0.5－15μl的溶液，样品溶液一般以毛细点详管加于滤纸距底边2cm左右的起点上。定量分析实验中，则需使用微量注射器或刻度毛细管点样。点样时应注意：

①点样斑点：直径不应超过0.5ｃｍ，亦可点成3-5ｍｍ的横条带。为防止样品斑点过大，可以采用少量多次点样的方法。即每次点加少量样品后立即吹干，然后再进行下一次．点样，如此反复直至达到事先设定的点样量为止。②样品间距：当在一张滤纸上同时进行多个样品的层析时，各样品点间的距离应在2ｃｍ以上，以防展开时样品间的互相影响。③点样量往往需要通过预试来确定合适的点样量。一般地说，单向纸层析的点样体积一般在2-20μL之间，点样量约为10-30μg；双向纸层析所需的样品量更大，一般为上述用量的2-3倍。4．展开方式

根据溶剂的展开方向，纸层析多采用上行法和下行法进行。对于一些组成复杂的样品，有时先用一种溶剂系统展开，冷风吹干后再以另一种溶剂系统在与前垂直的方向作第二次展开，此即双向纸层析。在纸层析过程中需要特别注意的是要将点好样的滤纸置于层析缸中，密封，使滤纸及层析缸内空气被溶剂蒸气充分饱和后，再将滤纸浸入层析液开始层析。

5．显色与定量层析结束后，取出滤纸并立即标记溶剂前沿，待滤纸干后可以通过下述几方面进行显色与分析：①直接观察：对于某些本身带有明显颜色的样品，可直接测算其Rf值并进行定量分析。②荧光③显色法：通过在层析后的滤纸上喷洒或熏蒸化学试剂，使本来无色的成分斑点反应或被染色成有色斑点，从而显示出来。例如：在碘的熏蒸下，大多数有机物都可呈现棕褐色；肽及氨基酸可以用茚三酮来显色；生物碱在碘化铋或碘化铋钾的作用下呈现橘黄色斑点等。④生物自显影：在追踪某些活性植物