山大生化实验报告 实验九 肌糖原的酵解

肌糖原的酵解作用姓名：周超学号：201100140067班级：11级生命基地同组者：刘炳煜时间：2011年5月14日【实验目的】1、了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。2、学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。【实验原理】在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例。肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖元首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式：（1/n）(C6H10O5)n+H2O CH3CHOHCOOH肌糖元的酵解作用是糖类供给能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖元的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖元的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。糖元酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖后，乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质，根据颜色的显现加以鉴定。该法比较灵敏，每毫升溶液含1——5ug乳酸即给出明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除尽这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。【实验试剂】1、鸡肌肉糜2、1／15mol/L磷酸缓冲液(pH7．4)：3、对羟基联苯试剂：称取对羟基联苯1．5g溶于100ml0.5％NaOH中，配成1.5％的溶液。若对经基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶，放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。淀粉溶液：0.5%5、液体石蜡6、CuSO4饱和溶液7、Ca（OH）2粉末：8、20%三氯乙酸9、浓硫酸【实验步骤】肌肉糜的糖酵解取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5克。1，2号管为样品管，3，4号管为空白管。向3，4号空白管内加入20%三氯乙酸4mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后分别向4支试管内加入4mL磷酸缓冲液和1mL0.5%淀粉溶液。3，4管用玻璃棒充分搅匀，加液体石蜡以隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃1h后，取出试管，立即向1，2号试管内各加入20%三氯乙酸4mL，充分混匀，过滤。然后向每管（一次性试管）内加入饱和硫酸铜溶液1mL，混匀，再加入0.4克氢氧化钙粉末，充分搅匀2min，放置10min，使还原糖沉淀完全，过滤，保留滤液。样品空白1234肌肉糜0.5g0.5g0.5g0.5g20%三氯乙酸/ml33磷酸缓冲液/ml33330.5%淀粉/ml1111充分摇匀，加液体石蜡封口隔绝空气，37度保温1h，吸出石蜡油20%三氯乙酸/ml33饱和CuSO4/ml1111Ca(OH)2粉末/g0.40.40.40.4充分摇匀，震荡10min，并不时搅动内容物，分别过滤，弃除沉淀。2、乳酸的测定取4支洁净、干燥试管，编号，各加入浓硫酸2mL，将试管置于冰水浴中冷却，分别取每个样品的滤液2滴，直接加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。将每个试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min，加入对羟联苯试剂2滴，混匀试管内容物，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。【实验结果】样品空白1234颜色反应淡紫色紫色白色（放置一段时间后，略带黄色）白色（放置一段时间后，略带黄色）【思考讨论】1、结果分析：（1）本次实验较为成功，样品管呈紫色或淡紫色，空白管呈白色，对比明显，从结果中可以得出，肌糖原的酵解产生了乳酸，乳酸与浓硫酸作用可以产生乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生了紫色物质，从样品管的颜色深浅来看，本次实验产生的乳酸的量较少。（2）样品1呈淡紫色，较样品2颜色浅，分析原因可能是，加入样品滤液和对羟基联苯时，有些加到了壁上，减弱了显色效果。注意事项：（1）30%三氯乙酸的作用是使肌肉糜失活(即肌肉糜中的蛋白失活)，因此在用30%三氯乙酸处理空白管中的肌肉糜时，一定要充分，直至肌肉变为惨白色为止，在处理过程中，可使用玻璃棒不断搅捻肌肉糜，使其充分接触三氯乙酸，以使肌肉糜完全失活。（2）加液体石蜡目的是隔绝空气，给反应体系创造无氧环境，加入的石蜡不用太多，刚好把口封住最佳。（3）37度保温时间1-1.5h，可通过前期的预实验确定最佳保温时间。（4）在加入饱和CuSO4之前需将肌肉糜挑出。（5）加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末的作用是去除反应体系中的糖和蛋白质，加入饱和CuSO4和Ca(OH)2粉末如一定要充分震荡10min，使CuSO4、Ca(OH)2和反应体系充分接触，完全去除多余的糖和蛋白质。（6）乳糖的测定中，在加入样品滤液和对羟基联苯时，一定不要加到壁上，否则会对结果造成干扰。讨论实验成功的两个关键步骤：（1）向空白管加入30%三氯乙酸。30%三氯乙酸的作用是使肌肉糜失活，这一步一定要保证肌肉糜完全失去活性，以增强最终显色的比色效果，判定肌肉糜失活的标识是肌肉糜呈惨白