活细胞工作站的应用课件

形态暨影像公共平台生理129室

形态暨影像公共平台生理129室形态暨影像公共平台激光共聚焦显微镜(LaserScanConfocalMicroscope，LSCM，Leica)流式细胞仪(Flowcytometry，BD)形态暨影像公共平台激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜

(LaserScanConfocalMicroscope)仪器名称：Leica激光共聚焦显微镜型号：LeicaTCSSP5II国别：德国徕卡激光共聚焦显微镜

(LaserScanConfocal主要技术指标1.激光器：

HeNeRed:633nm；

HeNeGreen:543nm；

Ar:458nm,476nm,488nm,514nm；近紫外:405nm。2.检测通道：3个光谱型检测通道，检测波长范围400-800nm。3.扫描系统：线扫描速度(双向)：2800线/sec，连续可调；扫描分辨率：8192×8192像素；最大帧频：512×512主要技术指标1.激光器：物镜的配置10×；20×；40×；63×(油镜)；63×(水镜)；物镜的配置10×；利用水浸物镜进行长期活细胞观察水浸物镜可以获得最高的分辨率和对比度。自动加水设备，保证移入样本后对比度不会下降。无对焦错误,运动过程中水膜不会破裂。利用水浸物镜进行长期活细胞观察水浸物镜可以获得最高的分辨率和应用范围：用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋白质复合体等的转运、分子相互作用、细胞骨架的动态变化、细胞分裂和细胞器发生过程等);对细胞内结构和活动进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察。研究方法包括免疫荧光染色（单染、双染、三染）、活细胞荧光标标记、FRAP(FlourescenceRecoveryAfterPhoto-bleaching)、FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)等。应用范围：用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋活细胞工作站的应用

(Livecellimagingsystem)荧光标记蛋白的长时间跟踪观测活细胞运动及形态跟踪观测荧光共定位荧光共振能量转移FRET荧光图像处理、测量活细胞工作站的应用

(Livecellimaging活细胞工作站的优点实时观测自动聚焦单细胞追踪多位点成像成像速度快活细胞工作站的优点实时观测活细胞工作站与共聚焦的区别活细胞工作站：细胞立体感强成像速度快：＜500ms光毒性小多点拍摄主要用于活细胞实时观察（GFP，CFP、YFP，RFP）激光共聚焦：平面扫描成像速度慢：1-2min清晰度较好光毒性主要用于固定后的组织、细胞。活细胞工作站与共聚焦的区别活细胞工作站：活细胞实验条件的控制温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气，物镜加热器，恒温箱）pH值的保持，即CO2的供应（5%CO2）；培养基离子浓度的保持；O2（95%O2）的要求。活细胞实验条件的控制温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气标本的准备要点尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（LabＴｅｋ）因为高数值孔经径物镜能发挥其最大效应。对于不容易在玻璃上生长的细胞，使用包被了poly-lysine或相似物质的玻璃底培养皿。标本的准备要点尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（Lab绿色荧光蛋白

（GreenFluorescentProtein，GFP）可溶性蛋白，性质稳定。荧光基团明亮。荧光在活细胞中即可观察，不需固定和加工。GFP基团和目的基因做成融合蛋白后，可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。表达GFP融合产物的细胞能在活的状态下进行实验和检测。绿色荧光蛋白

（GreenFluorescentProtTransfectionIncubatethecells:30-40%or70%-80%confluence.Transfection:lipofectamine2000Transienttransfection:usedforimagingdirectly.Selectstablecelllines:48h,G418,2-3weeks.TransfectionIncubatethecellCheckwhetherpDsRed1-mitocanprobemitochondriainCMs

byusingconfocalmicroscope

生理楼2012.09.04MitoGreenpDsRed1MitoMergeX63X63CheckwhetherpDsRed1-mitocan2.5h

2.5h

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(LaserScanConfocalMicroscope)仪器名称：Leica激光共聚焦显微镜型号：LeicaTCSSP5II国别：德国徕卡激光共聚焦显微镜

(LaserScanConfocal主要技术指标1.激光器：

HeNeRed:633nm；

HeNeGreen:543nm；

Ar:458nm,476nm,488nm,514nm；近紫外:405nm。2.检测通道：3个光谱型检测通道，检测波长范围400-800nm。3.扫描系统：线扫描速度(双向)：2800线/sec，连续可调；扫描分辨率：8192×8192像素；最大帧频：512×512主要技术指标1.激光器：物镜的配置10×；20×；40×；63×(油镜)；63×(水镜)；物镜的配置10×；利用水浸物镜进行长期活细胞观察水浸物镜可以获得最高的分辨率和对比度。自动加水设备，保证移入样本后对比度不会下降。无对焦错误,运动过程中水膜不会破裂。利用水浸物镜进行长期活细胞观察水浸物镜可以获得最高的分辨率和应用范围：用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋白质复合体等的转运、分子相互作用、细胞骨架的动态变化、细胞分裂和细胞器发生过程等);对细胞内结构和活动进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察。研究方法包括免疫荧光染色（单染、双染、三染）、活细胞荧光标标记、FRAP(FlourescenceRecoveryAfterPhoto-bleaching)、FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)等。应用范围：用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋活细胞工作站的应用

(Livecellimagingsystem)荧光标记蛋白的长时间跟踪观测活细胞运动及形态跟踪观测荧光共定位荧光共振能量转移FRET荧光图像处理、测量活细胞工作站的应用

(Livecellimaging活细胞工作站的优点实时观测自动聚焦单细胞追踪多位点成像成像速度快活细胞工作站的优点实时观测活细胞工作站与共聚焦的区别活细胞工作站：细胞立体感强成像速度快：＜500ms光毒性小多点拍摄主要用于活细胞实时观察（GFP，CFP、YFP，RFP）激光共聚焦：平面扫描成像速度慢：1-2min清晰度较好光毒性主要用于固定后的组织、细胞。活细胞工作站与共聚焦的区别活细胞工作站：活细胞实验条件的控制温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气，物镜加热器，恒温箱）pH值的保持，即CO2的供应（5%CO2）；培养基离子浓度的保持；O2（95%O2）的要求。活细胞实验条件的控制温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气标本的准备要点尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（LabＴｅｋ）因为高数值孔经径物镜能发挥其最大效应。对于不容易在玻璃上生长的细胞，使用包被了poly-lysine或相似物质的玻璃底培养皿。标本的准备要点尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（Lab绿色荧光蛋白

（GreenFluorescentProtein，GFP）可溶性蛋白，性质稳定。荧光基团明亮。荧光在活细胞中即可观察，不需固定和加工。GFP基团和目的基因做成融合蛋白后，可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。表达GFP融合产物的细胞能在活的状态下进行实验和检测。绿色荧光蛋白

（GreenFluorescentProtTransfectionIncubatethecells:30-40%or70%-80%confluence.Transfection:lipofectamine2000Transienttransfection:usedforimagingdirectly.Selectstablecelllines:48h,G418,2-3weeks.