细菌学检验-17-HLA检测课件

第十七章HLA分型检测技术

1

主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)：指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间免疫识别、调节免疫应答的一组紧密连锁的基因群。主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilityantigen，MHA)：MHC编码的基因产物，存在于所有有核细胞的表面。能引起快而强的排斥反应。

2人类MHC：HLA复合体位于第6号染色体短臂上。人类的主要组织相容性抗原－HLA（humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原）代表个体组织特异性的、引起强烈而讯速器官移植排斥反应的同种异型抗原。首先发现于白细胞表面，且白细胞是进行此类抗原研究的最适宜材料来源。人类MHC：HLA复合体3位置第6号染色体短臂，约长4000kb基因组成自着丝点起，依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因、Ⅰ类基因位置4HLA-Ⅰ类分子：包括HLA-

A、B、C

分布：所有有核细胞(含血小板和网织红细胞)表面。但成熟的红细胞、神经细胞、滋养层细胞不表达HLA-Ⅰ分子。以淋巴细胞密度最高。HLA-Ⅰ类分子：包括HLA-A、B、C5Ⅰ类基因经典HLA-AHLA-BHLA-C编码分子HLA-A分子HLA-B分子HLA-C分子功能参与内源性抗原递呈和免疫调控非经典HLA-EHLA-FHLA-G编码分子HLA-E分子HLA-F分子HLA-G分子功能参与免疫调控经典HLA-AHLA-BHLA-C编码分子HLA-A分子HL6HLA-Ⅱ类分子：包括HLA-DP、DQ、DR

主要分布于抗原提呈细胞（APC）表面。其表达水平与细胞分化及抗原刺激有关。某些情况下，活化的T细胞、胸腺上皮细胞、血管内皮细胞等也表达。细菌学检验-17-HLA检测课件7Ⅱ类基因经典HLA-DPHLA-DQHLA-DR编码分子HLA-DP分子HLA-DQ分子HLA-DR分子功能参与外源性抗原递呈和免疫调控抗原加工相关基因HLA-DMHLA-DOTAP1TAP2LMP2LMP7编码分子HLA-DMHLA-DO分子TAP1TAP2分子LMP2LMP7分子功能参与抗原加工递呈经典HLA-DPHLA-DQHLA-DR编码分子HLA-DP8LMP（lowmolecularweightpeptide）低分子量多肽基因包括LMP2和LMP7两基因，编码产物蛋白酶LMP2和LMP7，参与内源性抗原的加工LMP（lowmolecularweightpepti9TAP（transporterassociatedwithantigenprocessing）抗原加工相关转运体基因包括TAP1和TAP2两基因编码产物TAP分子参与内源性抗原肽的转运TAP（transporterassociatedwit10HLA-Ⅲ类基因位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因之间补体基因C4A、C4B、C2、Bf21-羟化酶基因CYP21A、CYP21B热休克蛋白基因HSP70细胞因子基因TNF、LTA、LTB

HLA-Ⅲ类基因位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因之间11HLA复合体的遗传特点单元型遗传共显性表达高度多态性连锁不平衡HLA复合体的遗传特点单元型遗传12细菌学检验-17-HLA检测课件13

共显性表达（Codominance）两条同源染色体上的一对等位基因共显性表达，都能编码相应的分子共显性表达（Codominance）两条同源染14细菌学检验-17-HLA检测课件15高度多态性（Polymorphism）多态性一群体概念，指一随机婚配的人群中，在一特定基因座位上以稳定频率出现的两种或两种以上的基因产物复等位基因共显性表达

高度多态性（Polymorphism）多态性16ThenumbersofHLAallelescurrentlyofficiallyassignedbytheWHONomenclatureCommitteeforFactorsoftheHLASystemasofAugust2000.

ThenumbersofHLAallelescur17PolymorphisminMHCClassIgenes555291140Datafrom.uk/HIG/index.htmlOctober2003998alleles(657inJuly2000)6215ClassIABCNoofpolymorphismsEFGPolymorphisminMHCClassIge18PolymorphisminMHCClassIIgenes3356201062556Datafrom.uk/HIG/index.htmlOctober2003668alleles(492inJuly2000)764688DRDPDQDMDOClassIIAB1A1B1B2-9A1B1NoofpolymorphismsABABPolymorphisminMHCClassIIg19连锁不平衡（Linkagedisequilibrium）指在某一群体中，不同座位上某两个基因出现在同一条单元型上的频率与期望值之间有显著差异的现象HLA-DRB1*0901基因频率15.6%HLA-DQB1*0701基因频率21.9%连锁理论频率3.4%（0.156×0.219）连锁实际频率11.3%连锁不平衡（Linkagedisequi20

HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。检测方法有血清学分型、细胞学分型和分子生物学分型方法。

HLA分型使HLA复杂的多态性更得以显露，推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，促进了对疾病本质的认识。

HLA分型应用于器官移植、法医鉴定、遗传学研究探讨与疾病的相关性等领域。

HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。21一、原理：抗原抗体反应方法：微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细胞毒试验(micro-complementdependentcytotoxicity，CDC)分型抗原：SD抗原(serologicallydefinedantigen)，包括HLA-A、B、C、DR、DQ。第一节HLA血清学分型法一、原理：抗原抗体反应第一节HLA血清学分型法22CDC试验原理：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。标准血清+淋巴细胞→抗原抗体复合物+补体→溶解细胞+染料（台盼蓝、伊红）→计数死细胞数CDC试验原理：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激23微量细胞毒试验判定标准死(着染)细胞%

记分

结果判断0～101阴性11～202可疑阳性21～504弱阳性51～806阳性>80

8强阳性未试验或不能读数

微量细胞毒试验判定标准死(着染)细胞%记分24

二、技术要点

1．CDC试验的关键在于获得标准抗血清。与ABO血型抗体不同，主要获自经产妇。2．抗血清种类应覆盖本民族、本地区80％以上的抗原。其中每一高频3份以上，低频2份以上。3．Ⅱ类抗原，仅分布于B细胞或巨噬细胞表面，故检测Ⅱ类抗原应分纯B细胞。二、技术要点25

4、注意下列假象

①粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。②血小板与淋巴细胞竞争，结合HLA抗体而导致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。③红细胞沾染易致假阳性。④单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于CDC，可改用ELISA、FCM。4、注意下列假象26三、临床应用

1．HLA配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。2．HLA交叉配型即用CDC法检测受体血清有无针对供者HLA的抗体，以监测排斥反应的发生或估价受体的敏感性。3．群体反应性抗体的检测(Panelreactiveantibody，PRA)

PRA用于判断器官移植时受体的敏感程度，可用40～60人混合T、B细胞，检测受者血清抗体阳性百分数，高PRA血清受体对所接受的移植物构成威胁。三、临床应用27

方法：混合淋巴细胞培养(mixedlymphocyteculture，MLC)

混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)

分型抗原：LD抗原(1ymphocytedefinedantigen)：包括HLA-D、DP第二节细胞学分型法第二节细胞学分型法28MLC试验方法：

反应细胞（受者淋巴细胞）+刺激细胞（供者或已知标准株淋巴细胞）→不处理→双向（丝裂霉素c或x线照射预处理）→单向（目前仍使用）反应管→混合培养观察反应细胞对刺激细胞发生应答、转化（涂片、染色、3H-TdR刺激指数SI）MLC试验方法：29

结果与评价：

双向单向结果两细胞反应之和待检细胞的反应公式SI=2×试验管cpm/(A+B)对照SI=试验管cpm/自身对照评价反映两种细胞间LD的差别，不能作LD抗原分型

可用于作HLA-D、DP分型

结果与评价：

双向单向结果两细胞反应之和待检细胞301．阴性分型法

纯合子分型细胞试验(homozygoustypingcell，HTC)

纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，只表达一种LD抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。

1．阴性分型法31试验：将一组HTC作刺激细胞，作单向MLC。结果：待检与刺激细胞的LD不同————发生反应

待检与刺激细胞的LD相同————不反应要找的就是相同细胞故为阴性分型法。

SI≤2，DNV(doublenormalizedvalue)<30阴性评价：HTC难以获得，尸体不能用试验：将一组HTC作刺激细胞，作单向MLC。322．阳性分型法

预致敏淋巴细胞分型法(primedlymphocytetyping，PLT)预备：选择只有一个单倍型不同的两个个体a/b和a/c

刺激细胞a/b+反应细胞a/c→单向MLC→得到针对b特异免疫应答能力的PLT依此类推，可得到一系列识别各种已知LD抗原的一套PLT2．阳性分型法33

试验：待检（刺激细胞）

PLT（反应细胞）———单向MLC

结果：待检与PLT相同———快速反应（二次应答）待检与PLT不同————无反应要找的是相同的细胞，故为阳性分型法

评价：克服HTC缺点，预试验复杂试验：待检（刺激细胞）34

又称DNA分型法：灵敏度高，陈旧微量标本可检测，克服CDC和MLC的不足，前景广阔。第三节HLA基因分型法又称DNA分型法：灵敏度高，陈旧微量标本可检测，克服35

一、PCR-RFLP分型法方法：PCR扩增的基因片段→等位特异的内切酶消化→切成长度不一、数量不等的基因片段→电泳分离，根据一系列内切酶解格局可确定PCR扩增产物的基因型。关键：预知Ⅱ类基因的核苷酸序列，并据此找到合适的内切酶。评价：不需同位素，简便，适合小规模分型。一、PCR-RFLP分型法36二、PCR-SSOP分型法

方法：

HLA基因→杂交←序列特异性寡核苷酸探针（PCR扩增）（32P、酶、地高辛、生物素标记）一个探针只能与其结构互补的PCR产物杂交，据探针杂交格局，即能判断扩增片段的HLA基因型。

关键：预先知道Ⅱ类基因的核苷酸序列，设计出恰当的探针。

评价：需合成大量DNA探针，操作步骤多，适合大规模分型和配型。二、PCR-SSOP分型法37

方法：采用一系列设计的特异性引物，作HLA基因PCR扩增，一对特异性引物只能扩增出结构与其互补的基因片段，根据引物扩增结果，能确定检样的基因型。

评价：只需作PCR扩增及PCR产物检测，快速简便。三、PCR-SSP分型法方法：采用一系列设计的特异性引物，作HLA基因三、PCR38

是在完成目的DNA扩增后，进行单链DNA多态性分析的一种新方法。原理：根据单链DNA在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，可形成一定的空间结构和构象的特点，将HLA基因扩增产物变性后，因其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同、电泳时泳动速度和迁移率也不相同，因此在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳图谱不同，据此可分析HLA基因的多态性。

评价：灵敏度较高，利于探测新的等位基因。操作复杂，影响因素多，不容易控制。四、PCR-SSCP分型法是在完成目的DNA扩增后，进行单链DNA多态性39五、SBT分型法（sequence-basedHLAtypingSBT）方法：PCR扩增出的HLA基因片段纯化，自动测序仪测序评价：直接、精确、价格昂贵，主要用于新等位基因的鉴定

五、SBT分型法40六、基因芯片1、高灵敏度2、高效性3、特异性高，客观性强4、检测成本低，自动化程度高，有利于大规模推广应用基因芯片技术将成为一种理想高效的HLA分型检测技术六、基因芯片1、高灵敏度基因芯片技术将成为一种理想高效的HL41一、HLA与器官移植

(一)HLA配型(二)HLA交叉配型与预存抗体的检测HLA分型的实际应用一、HLA与器官移植HLA分型的实际应用42

1、淋巴细胞交叉配合试验(1ymphecytecytotoxtcltycrossmatching)

检测受者是否有抗供者的特异性抗体

LD抗原的相容程度如何供者淋巴细胞+受者血清→CDC

细胞毒性>10%，受抗供

1、淋巴细胞交叉配合试验43还可进一步作T、B细胞淋巴细胞毒性交叉配型

细胞交叉配型阳性视为移植的禁忌症

B细胞交叉配型对于弱Ⅰ类抗体更敏感还可进一步作T、B细胞淋巴细胞毒性交叉配型44

2、流式细胞法交叉配型

(

flow-cytometrycrossmatching，FCC)

供者淋巴细胞+受者血清→共育用流式细胞仪检测

3、混合淋巴细胞培养供受者淋巴细胞单或双向MLC

检测HLAⅡ类抗原相容性

4、自身交叉配型（autocrossmatching）

受者血清＋受者细胞→细胞毒试验若阳性可致与供者的交叉配型出现假阳性2、流式细胞法交叉配型45

交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体作受体选择时：

组织配型差，交叉配型阴性，仍可移植组织配型好，交叉配型阳性，不宜移植交叉配型常用于肾移植而不用于心、肝、肺等

交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体46二、HLA与AID(自身免疫性疾病）寻找与某些疾病相关的HLA型别，研究其发生的遗传背景，这些疾病中以AID居多胰岛素依赖性糖尿病：华人DR9，白人DR4强直性脊柱炎：B27SLE：DR3HLA分型的实际应用二、HLA与AID(自身免疫性疾病）HLA分型的实际应用47三、HLA与输血反应

非溶血性输血反应与患者血清中存在HLA抗体相关，可用HLA分型法检测供者HLA型别和HLA抗体。三、HLA与输血反应48四、HLA与法医鉴定

HLA等位基因的多态性是个体的终生遗传标记，无血缘关系的人群中HLA表型完全相同者极罕见，在同一家族内HLA以单倍型方式遗传，据此作亲子鉴定、法医鉴定。四、HLA与法医鉴定49

第十七章HLA分型检测技术

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主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)：指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间免疫识别、调节免疫应答的一组紧密连锁的基因群。主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilityantigen，MHA)：MHC编码的基因产物，存在于所有有核细胞的表面。能引起快而强的排斥反应。

51人类MHC：HLA复合体位于第6号染色体短臂上。人类的主要组织相容性抗原－HLA（humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原）代表个体组织特异性的、引起强烈而讯速器官移植排斥反应的同种异型抗原。首先发现于白细胞表面，且白细胞是进行此类抗原研究的最适宜材料来源。人类MHC：HLA复合体52位置第6号染色体短臂，约长4000kb基因组成自着丝点起，依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因、Ⅰ类基因位置53HLA-Ⅰ类分子：包括HLA-

A、B、C

分布：所有有核细胞(含血小板和网织红细胞)表面。但成熟的红细胞、神经细胞、滋养层细胞不表达HLA-Ⅰ分子。以淋巴细胞密度最高。HLA-Ⅰ类分子：包括HLA-A、B、C54Ⅰ类基因经典HLA-AHLA-BHLA-C编码分子HLA-A分子HLA-B分子HLA-C分子功能参与内源性抗原递呈和免疫调控非经典HLA-EHLA-FHLA-G编码分子HLA-E分子HLA-F分子HLA-G分子功能参与免疫调控经典HLA-AHLA-BHLA-C编码分子HLA-A分子HL55HLA-Ⅱ类分子：包括HLA-DP、DQ、DR

主要分布于抗原提呈细胞（APC）表面。其表达水平与细胞分化及抗原刺激有关。某些情况下，活化的T细胞、胸腺上皮细胞、血管内皮细胞等也表达。细菌学检验-17-HLA检测课件56Ⅱ类基因经典HLA-DPHLA-DQHLA-DR编码分子HLA-DP分子HLA-DQ分子HLA-DR分子功能参与外源性抗原递呈和免疫调控抗原加工相关基因HLA-DMHLA-DOTAP1TAP2LMP2LMP7编码分子HLA-DMHLA-DO分子TAP1TAP2分子LMP2LMP7分子功能参与抗原加工递呈经典HLA-DPHLA-DQHLA-DR编码分子HLA-DP57LMP（lowmolecularweightpeptide）低分子量多肽基因包括LMP2和LMP7两基因，编码产物蛋白酶LMP2和LMP7，参与内源性抗原的加工LMP（lowmolecularweightpepti58TAP（transporterassociatedwithantigenprocessing）抗原加工相关转运体基因包括TAP1和TAP2两基因编码产物TAP分子参与内源性抗原肽的转运TAP（transporterassociatedwit59HLA-Ⅲ类基因位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因之间补体基因C4A、C4B、C2、Bf21-羟化酶基因CYP21A、CYP21B热休克蛋白基因HSP70细胞因子基因TNF、LTA、LTB

HLA-Ⅲ类基因位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因之间60HLA复合体的遗传特点单元型遗传共显性表达高度多态性连锁不平衡HLA复合体的遗传特点单元型遗传61细菌学检验-17-HLA检测课件62

共显性表达（Codominance）两条同源染色体上的一对等位基因共显性表达，都能编码相应的分子共显性表达（Codominance）两条同源染63细菌学检验-17-HLA检测课件64高度多态性（Polymorphism）多态性一群体概念，指一随机婚配的人群中，在一特定基因座位上以稳定频率出现的两种或两种以上的基因产物复等位基因共显性表达

高度多态性（Polymorphism）多态性65ThenumbersofHLAallelescurrentlyofficiallyassignedbytheWHONomenclatureCommitteeforFactorsoftheHLASystemasofAugust2000.

ThenumbersofHLAallelescur66PolymorphisminMHCClassIgenes555291140Datafrom.uk/HIG/index.htmlOctober2003998alleles(657inJuly2000)6215ClassIABCNoofpolymorphismsEFGPolymorphisminMHCClassIge67PolymorphisminMHCClassIIgenes3356201062556Datafrom.uk/HIG/index.htmlOctober2003668alleles(492inJuly2000)764688DRDPDQDMDOClassIIAB1A1B1B2-9A1B1NoofpolymorphismsABABPolymorphisminMHCClassIIg68连锁不平衡（Linkagedisequilibrium）指在某一群体中，不同座位上某两个基因出现在同一条单元型上的频率与期望值之间有显著差异的现象HLA-DRB1*0901基因频率15.6%HLA-DQB1*0701基因频率21.9%连锁理论频率3.4%（0.156×0.219）连锁实际频率11.3%连锁不平衡（Linkagedisequi69

HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。检测方法有血清学分型、细胞学分型和分子生物学分型方法。

HLA分型使HLA复杂的多态性更得以显露，推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，促进了对疾病本质的认识。

HLA分型应用于器官移植、法医鉴定、遗传学研究探讨与疾病的相关性等领域。

HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定。70一、原理：抗原抗体反应方法：微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细胞毒试验(micro-complementdependentcytotoxicity，CDC)分型抗原：SD抗原(serologicallydefinedantigen)，包括HLA-A、B、C、DR、DQ。第一节HLA血清学分型法一、原理：抗原抗体反应第一节HLA血清学分型法71CDC试验原理：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。标准血清+淋巴细胞→抗原抗体复合物+补体→溶解细胞+染料（台盼蓝、伊红）→计数死细胞数CDC试验原理：当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激72微量细胞毒试验判定标准死(着染)细胞%

记分

结果判断0～101阴性11～202可疑阳性21～504弱阳性51～806阳性>80

8强阳性未试验或不能读数

微量细胞毒试验判定标准死(着染)细胞%记分73

二、技术要点

1．CDC试验的关键在于获得标准抗血清。与ABO血型抗体不同，主要获自经产妇。2．抗血清种类应覆盖本民族、本地区80％以上的抗原。其中每一高频3份以上，低频2份以上。3．Ⅱ类抗原，仅分布于B细胞或巨噬细胞表面，故检测Ⅱ类抗原应分纯B细胞。二、技术要点74

4、注意下列假象

①粒细胞和单核细胞能够非特异性地吞噬染料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。②血小板与淋巴细胞竞争，结合HLA抗体而导致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。③红细胞沾染易致假阳性。④单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于CDC，可改用ELISA、FCM。4、注意下列假象75三、临床应用

1．HLA配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。2．HLA交叉配型即用CDC法检测受体血清有无针对供者HLA的抗体，以监测排斥反应的发生或估价受体的敏感性。3．群体反应性抗体的检测(Panelreactiveantibody，PRA)

PRA用于判断器官移植时受体的敏感程度，可用40～60人混合T、B细胞，检测受者血清抗体阳性百分数，高PRA血清受体对所接受的移植物构成威胁。三、临床应用76

方法：混合淋巴细胞培养(mixedlymphocyteculture，MLC)

混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)

分型抗原：LD抗原(1ymphocytedefinedantigen)：包括HLA-D、DP第二节细胞学分型法第二节细胞学分型法77MLC试验方法：

反应细胞（受者淋巴细胞）+刺激细胞（供者或已知标准株淋巴细胞）→不处理→双向（丝裂霉素c或x线照射预处理）→单向（目前仍使用）反应管→混合培养观察反应细胞对刺激细胞发生应答、转化（涂片、染色、3H-TdR刺激指数SI）MLC试验方法：78

结果与评价：

双向单向结果两细胞反应之和待检细胞的反应公式SI=2×试验管cpm/(A+B)对照SI=试验管cpm/自身对照评价反映两种细胞间LD的差别，不能作LD抗原分型

可用于作HLA-D、DP分型

结果与评价：

双向单向结果两细胞反应之和待检细胞791．阴性分型法

纯合子分型细胞试验(homozygoustypingcell，HTC)

纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，只表达一种LD抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。

1．阴性分型法80试验：将一组HTC作刺激细胞，作单向MLC。结果：待检与刺激细胞的LD不同————发生反应

待检与刺激细胞的LD相同————不反应要找的就是相同细胞故为阴性分型法。

SI≤2，DNV(doublenormalizedvalue)<30阴性评价：HTC难以获得，尸体不能用试验：将一组HTC作刺激细胞，作单向MLC。812．阳性分型法

预致敏淋巴细胞分型法(primedlymphocytetyping，PLT)预备：选择只有一个单倍型不同的两个个体a/b和a/c

刺激细胞a/b+反应细胞a/c→单向MLC→得到针对b特异免疫应答能力的PLT依此类推，可得到一系列识别各种已知LD抗原的一套PLT2．阳性分型法82

试验：待检（刺激细胞）

PLT（反应细胞）———单向MLC

结果：待检与PLT相同———快速反应（二次应答）待检与PLT不同————无反应要找的是相同的细胞，故为阳性分型法

评价：克服HTC缺点，预试验复杂试验：待检（刺激细胞）83

又称DNA分型法：灵敏度高，陈旧微量标本可检测，克服CDC和MLC的不足，前景广阔。第三节HLA基因分型法又称DNA分型法：灵敏度高，陈旧微量标本可检测，克服84

一、PCR-RFLP分型法方法：PCR扩增的基因片段→等位特异的内切酶消化→切成长度不一、数量不等的基因片段→电泳分离，根据一系列内切酶解格局可确定PCR扩增产物的基因型。关键：预知Ⅱ类基因的核苷酸序列，并据此找到合适的内切酶。评价：不需同位素，简便，适合小规模分型。一、PCR-RFLP分型法85二、PCR-SSOP分型法

方法：

HLA基因→杂交←序列特异性寡核苷酸探针（PCR扩增）（32P、酶、地高辛、生物素标记）一个探针只能与其结构互补的PCR产物杂交，据探针杂交格局，即能判断扩增片段的HLA基因型。

关键：预先知道Ⅱ类基因的核苷酸序列，设计出恰当的探针。

评价：需合成大量DNA探针，操作步骤多，适合大规模分型和配型。二、PCR-SSOP分型法86

方法：采用一系列设计的特异性引物，作HLA基因PCR扩增，一对特异性引物只能扩增出结构与其互补的基因片段，根据引物扩增结果，能确定检样的基因型。

评价：只需作PCR扩增及PCR产物检测，快速简便。三、PCR-SSP分型法方法：采用一系列设计的特异性引物，作HLA基因三、PCR87

是在完成目的DNA扩增后，进行单链DNA多态性分析的一种新方法。原理：根据单链DNA在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，可形成一定的空间结构和构象的特点，将HLA基因扩增产物变性后，因其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同、电泳时泳动速度和迁移率也不相同，因此在中性聚丙烯酰胺凝胶中的