综述-脂肪干细胞与脂肪移植

脂肪干细胞春脂肪鲍松额域的鹿/王岩斐自从美国加州大学洛杉矶分校(UniversityofCalifornia,LosAngeles,UCLA)的研究人员在《细胞分子生物学》(MolecularBiologyoftheCell)杂志介绍了这种新型成体干细胞群以后，脂肪干细胞(theadipose-derivedstemcells,ADSCs)逐渐成为普遍应用于干细胞领域中的最受欢迎的干细胞群［1］。由于其自身存在的多向分化潜能，和获取ADSCs的简单实用性，ADSCs将成为多能胚胎干细胞(pluripotentEScells)的替代物，无论是在实验室仍是在临床应用中。长期以来，对于各类原发的和继发的软组织缺损的医治一直是困扰整形外科医生的难题之一。引发软组织缺损的原因有严重烧伤、感染、体表肿瘤切除术后、各类外伤和先本性疾病等［2］。自体脂肪作为一种软组织填充物，由于其诸多的并发症曾一度被人们放弃，但随着组织工程技术及细胞生物学的发展，自体脂肪移植又逐渐被人们认可。现将脂肪干细胞在脂肪移植中的作用及其临床应用现状综述如下。1脂肪移植的发展概况20世纪初，自体脂肪颗粒作为一种软组织填充材料开始应用于临床。但是，由于其吸收率高、存活率低，且并发症较多，限制了其在临床中的普遍应用［3］。21世纪初，通过改良脂肪获取技术，加速了脂肪血管化，提高了脂肪颗粒移植的成活率。可是，坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。直到Zuk等［1］第一次从自体脂肪组织中分离取得具有多向分化潜能的细胞一一ADSCs，脂肪移植的研究愈来愈深切，原因就是ADSCs来源丰硕，取材方便，且组织中干细胞含量丰硕（ADSCs在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10%-20%［4］），不会引发伦理学争议等。最近几年来，随着组织工程技术的迅速发展，为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题，如吸收、囊肿、硬结等，Yoshimura等［5］又发明了细胞辅助的脂肪移植术（cell-assistedlipotransfer,CAL），该技术是将ADSCs与脂肪细胞混合，联合注射移植。2脂肪来源干细胞（ADSCs）与脂肪移植概述人类的脂肪组织主要由成熟脂肪细胞组成，大约占90%；另外，在间质中还有前脂肪细胞、成纤维细胞、光滑肌细胞和内皮细胞［2］。除此之外，从人的脂肪组织中还可以分离出类似于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞群——脂肪来源干细胞（ADSCs），拥有多向分化潜能。ADSCs也属于来自中胚层的成体干细胞，其体外扩增和自我更新能力很强，通过诱导培育可分化为脂肪细胞、骨和软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、血管内皮细胞等等。人体内存在棕色和白色两种脂肪。研究发现，多向分化潜能的干细胞在鼠的白色脂肪组织中很丰硕，而在棕色脂肪组织中它们的含量就相对少了很多［6］。目前，在人体内哪一种脂肪组织可以作为最好的干细胞来源尚无定论。将ADSCs放在脂肪诱导培育基中，可以表达脂蛋白脂肪酶，aP2,PPAR（gamma）2和Glut4等脂肪细胞相关基因E。在体内，ADSCs的成脂能力已取得证明。有研究［8］将ADSCs与海绵状胶原复合后植入免疫缺点小鼠体内，形成了脂肪样组织。但是,脂肪组织本身就有大量脂肪前体细胞，且脂肪细胞本身也具有增殖能力，因此，下一步研究应进一步明确该脂肪样组织的细胞来源问题［9］。ADSCs在脂肪移植中的作用脂肪移植后脂肪组织的存活与萎缩的机制并未取得证明。无微血管存在的脂肪组织在移植后处于相对缺血区，最初几天的营养灌注来自宿主组织周围组织，直到形成新的微血管。对于损伤的反映，在组织修复进程中，脂肪细胞（对缺氧很敏感）在氧压低于其阈值的情况下，24h内可能死亡。可是，ADSCs更能耐受缺氧，其在缺氧的情况下可维持功能72血0］。在动物模型的缺血再灌注损伤的脂肪组织中，ADSCs在脂肪移植的修复进程中及在脂肪化和血管化中起着重要的作用［11］，其可调节周围组织中生长激素及细胞因子的释放［12］，并通过分泌各类生长因子如VEGF（血管内皮生长因子）、IGF-1（胰岛素样生长因子）避免细胞凋亡［13］，使脂肪组织的再生和凋亡达到平衡。ADSCs存在于脂肪细胞之间、血管壁、结缔组织中，但大部份聚集在血管周围。其在缺氧条件下可释放血管形成因子［14-15］，并可分化为血管内皮细胞［16］，表现为成血管特性，成为医治局部缺血性疾病血管发生的最理想细胞来源。最近发现大鼠的脂肪祖细胞像血管管壁细胞一样存在于脂肪组织的血管中［17］，因此，ADSCs被以为是一种脂肪细胞和血管细胞的双重祖细胞。这样，当脂肪组织细胞凋亡后，ADSCs可提供新的脂肪原始细胞；同时，随着脂肪组织的老龄化、缺血或损伤，ADSCs还可影响微血管的重塑。咱们有理由相信，有功能的ADSCs的数量在组织修复和塑形中具有重要作用。ADSCs在细胞辅助的脂肪移植术（CAL）中的作用CAL技术是将新抽取的脂肪分为两份:一份用来提取SVF（自体脂肪干细胞，Stromalvascularfractioncells）,另一份作为提取的细胞外基质，两部份联合注射于受区［18］0Sterodimas［19］指出，通过吸脂方式获取的脂肪组织与完整的脂肪组织相较，ADSCs的数量只有原来的一半。其原因可能是一部份ADSCs停留于大血管周围或留在受体组织中，一部份ADSCs释放入吸脂脂肪的液体成份中［18］。这种低ADSCs比率可能是移植的脂肪组织长时间后萎缩的主要原因。最近的研究表明，脂肪来源干细胞辅助医治可提高存活脂肪的体积和质地。在CAL中，脂肪组织可作为有活力的生物支架，使新鲜的包括有ADSCs的SVF粘附在脂肪组织上，不仅增加了前体细胞的数量，还有利于组织血管的形成和ADSCs向脂肪组织的转归，提高了脂肪组织的成活率。Yoshimura［20］以为，ADSCs在CAL中的作用可能是：①分化成脂肪细胞并增进脂肪再生；②分化成血管内皮细胞和壁细胞，以增进血管化作用；③在缺氧、损伤等条件下可增进血管生长因子释放，如肝细胞生长因子（HGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）；④最有可能的就是ADSCs作为原始的ADSCs而成活。3脂肪来源干细胞（ADSCs）的分离、培育和鉴定ADSCs的分离和培育分离ADSCs的脂肪组织主要来源于抽脂术后废弃和切取的脂肪组织。良好的分离技术可取得更多数量的ADSCs，保证ADSCs的活性功能和维持其多向分化潜能。脂肪组织供体的不同可能也影响分离的ADSCs活性。一般以为，ADSCs的附着和增殖能力随供体年龄增加而降低。但Aust等［21］以为，ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。由于不同部位脂肪组织的生物代谢特点不同，来源于不同部位的ADSCs数量和分化潜能可能不同。Schipper等［22］发现，与腹部、大腿和乳房来源的脂肪组织相较，人前臂脂肪组织中含有更多的ADSCs。有研究还发现，不同脂肪组织中的ADSCs含量不同。ADSCs在鼠白色脂肪组织中的含量明显高于棕色脂肪组织。Zuk等四第一次从人脂肪抽吸物中分离出ADSCs，其方式简述如下：首先将脂肪抽吸物用生理盐水反复冲洗，加％。胶原酶，37°C消化1h,1200r/min离心10min，弃上清，取细胞沉淀加入DMEM培育液（含10%FBS）。细胞计数，每100mm2培育皿接种1X106个细胞，37C、5%CO2>100%饱和湿度条件下培育。24h后第一次换液，以后每周换液两次，细胞融合达80%时传代，细胞以2X104/cm2接种于新的培育皿内。初分离的细胞接种4h后开始贴壁，24h〜48h细胞形态呈小圆形，色深。48h后细胞呈梭形，生长有方向性。5〜6d后细胞呈集落样生长，有克隆形成。传代后细胞仍呈成纤维细胞样生长，经多次传代，细胞增殖速度无减慢，这表明ADSCs体外扩增能力强，易于传代培育。Kurita等［24］研究不同的离心力对分离ADSCs的影响，发现过度离心会破坏脂肪细胞和ADSCs,1200g为最佳离心力，能取得最大量的ADSCs。Matsumoto等［25］研究发现，人脂肪吸取物在4C下留宿保留，不会影响ADSCs的数量和生物活性。有研究者将ADSCs冻存后苏醒，发现其扩增和分化能力未丢失，形成的脂肪组织与新鲜分离的ADSCs形成的一样。这使得成立脂肪来源干细胞库成为可能，为ADSCs的应用提供了广漠的前景。ADSCs的表型与鉴定目前尚未发现ADSCs的特异细胞标记物。脂肪来源干细胞在形态上与骨髓间充质干细胞相似，无法从形态学上将二者区分。流式细胞仪分析显示，ADSCs和BMSCs的表面抗原表达大体相同，均表达CD13、CD2九、CD44、CD105,均不表达CD3一、CD34、CD4五、HLA2DR。但二者也存有不同。ADSCs为CD49d（+）、CD106（-），而BMSCs正好相反，CD49d（-）、CD106（+）网。将脂肪抽吸物按前述方式消化离心后，所得沉淀称为间质血管碎片（stromalvascularfraction,SVF）O在新鲜分离的SVF中，包括以下几种细胞群：血液来源的细胞（CD45+）、ADSCs（CD31-、CD34+、CD45-、CD90+、CD105-、CD146+）、内皮细胞（CD31+、CD34+、CD45-、CD90+、CD146+）、周细胞（CD31-、CD34-、CD45-、CD90+、CD105-、CD146+）和其他细胞四。有学者观察了ADSCs随着培育传代其免疫表型的转变，发现间充质细胞相关标记（CD13、CD2九、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166）在初分离的SVF中含量很低，随着传代次数增加而迅速升高［28］。干细胞相关标记CD34，在整个培育和传代进程中都有表达，但在SVF和传代初期的ADSCs中最高。内皮细胞相关的CD3一、CD144和血管内皮生长因子受体2在SVF中低表达，而且随着传代无明显改变㈣。ADSCs的成脂分化脂肪细胞的分化全进程为：多能干细胞-脂肪母细胞-前脂肪细胞-不成熟脂肪细胞-成熟脂肪细胞。脂肪来源干细胞在分化诱导培育基的作用下可以分化为脂肪细胞，在基础培育基中，加入0.5mM异丁基甲基黄嘌吟、50^M吲噪美辛、^M地塞米松，培育12〜14d后，油红O染色阳性表示有成熟脂肪细胞形成㈣。新形成的脂肪细胞也能表达脂蛋白酯酶（LPL）、过氧化物酶增殖物活化受体Y（peroxisomeproliferator-activatedreceptor丫,PPARy）、瘦素等，表示该脂肪细胞是由脂肪干细胞诱导分化而来四。结合各类生物支架材料，ADSCs在动物体内也能成功分化形成新的成熟脂肪细胞，而且在一些刺激因子（如胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子等）的作用下，能提高ADSCs的成脂活性四。4临床应用ADSCs的优势及应用策略与骨髓间充质干细胞相较，ADSCs有以下长处：①脂肪组织储量丰硕，来源充沛，取材量大，能反复取材；②组织获取方式简单，只需通过吸脂术等简单的手术方式，不会给患者造成大的痛苦和二次伤害闵；③脂肪组织中干细胞含量丰硕，比骨髓中干细胞高出500倍㈣；④属于自体移植，无免疫排斥反映；⑤不涉及医学伦理问题。因此，ADSCs成为组织再生和修复的理想细胞来源。目前，多采用组织工程策略，利用ADSCs来构建脂肪组织。这对于种子细胞和支架材料的选择，细胞培育的环境和转移方式都有很高的要求。虽然有很多学者致力于支架材料的研究，将材料进行表面修饰或改形，以提高细胞的黏附增殖能力，但至今仍没有一种令临床满意的支架材料。因此，必需寻求新的途径和方式。ADSCs的临床应用现状目前，脂肪来源干细胞的应用研究多停留在动物实验阶段。日本和欧洲某些国家已开始利用人ADSCs，构建组织工程化脂肪组织，用于修复软组织缺损。ADSCs临床应用安全性评价及存在问题据最近的文献报导，干细胞长期体别传代，表型将发生改变。培育初期的干细胞维持多向分化的潜能，而培育至晚期的干细胞则表现出一些老化特征，并有细胞癌变的发生。另外，ADSCs的诱导液还常含有与肿瘤发生转移有关的生长因子，且价钱昂贵。因此，如何高效、廉价、安全地诱导ADSCs分化和应用是目前急需解决的难题。总之，随着分子生物学和细胞生物学的不断发展，关于ADSCs的研究也会不断深切。虽然ADSCs应用于脂肪移植临床实践的安全性和长期有效性等有待于进一步的评估，其作用机制也有待于进一步的研究，但笔者相信，由于其独特的优越性，ADSCs必将在整形美容外科领域成为一种理想的软组织填充物。参考文献：PatriciaA.Zuk.TheAdipose-derivedStemCell:LookingBackandLookingAhead.MolBiolCell,,1783-1787,June1,2010.GOMILLIONCT,BURGKJ.StemcellsandadiposetissueengineeringJ].Biomaterials,2006,27(36):6052-6063.王洁晴，柏树令.脂肪来源干细胞研究及临床应用现状.中国美容整形外科杂志2009年4月第20卷第4期.杨晓楠，毕会，张兰成，濮礼臣脂肪干细胞在脂肪组织工程领域的应用.中华医学美学美容杂志2009年10月第15卷第5期.YoshimuraK,ShigeuraT,MatsumotoD,etal.Characterizationoffreshlyisolatedandculturedcellsderivedfromthefattyandfluidportionsofliposuctionaspirates[J].JCellPhysiol,2006,208⑴：64-76.Prunet-MarcassusB,CousinB,CatonD,etal.Fromheterogeneitytoplasticityinadiposetissues:SitespecificdifferencesJ].ExpCellRes,2006,312:727-736.WickhamMQ,EricsonGR,GimbleJM,etal.MultipotentstromalcellsderivedfromtheinfrapatellarfatpadofthekneeJ].ClinOrthop,2003,412:196-212.vonHeimburqD,ZachariahS,HeschelI,etal.Humanpreadipocytesseededonfreeze-driedcollagenscaffoldsinvestigatedinvitroandinvivoJ].Biomaterials,2001,22(5):429-438.孙晓龙，李青.脂肪干细胞的研究及临床应用进展.第四军医大学学报2009,30(9).MyolotteLA,Duffy,MurphyM,etal.Metabolicflexibilitypermitsmesenchymalstemcellsurvivalinanischemicenvironment[J].StemCells,2008,26(5):1325-1336.SugaH,EtoH,ShigeuraT,etcollection:FGF-2-inducedHGFsecretionbyadipose-derivedstromalcellsinhibitspost-injuryfibrogenesisthroughaJNK-dependentmechanismJ].StemCells,2009,27(1):238-249.UysalAC,MizunoH,TobitaM,etal.TheEffectofAdipose-DerivedStemCellsonIschemia-ReperfusionInjury:ImmunohistochemicalandUltrastructuralEvaluation[J].PlastReconstrSurg,2009,124:804-815.ZhuM,ZhouZY,ChenY,etal.SupplementationofFatGraftsWithAdipose-DerivedRegenerativeCellsImprovesLong-TermGraftRetention[J].AnnPlastSurg,2010,64:222-228.RehmanJ,TraktuevD,LiJ,etal.SecrectionofangiogenicandantiapoptoticfactorsbyhumanadiposestromalcellsJ].Circulation,2004,109(10):1292-1298.ThangarajahH,VialIN,ChangE,etal.IFATScollection:AdiposeStromalcellsadoptaproangiogenicphenotypeundertheinfluenceofhypoxiaJ].StemCells,2009,27(1):266-274.CaoY,SunZ,LiaoLetal.Humanadiposetissue-derivedstemcellsdifferentiateintoendothelialcellsinvitroandimprovepostnatalneovascularizationinvivoJ].BiochemBiophysResCommun,2005,332(2):370-379.TangW,ZeveD,SuhJM,etal.Whitefatprogenitorcellsresideintheadiposevasculature[J].Science,2008,322(5901):583-586.YoshimuraK,SatoK,AoiN,etal.Cell-assistedlipotransfer(CAL)forcosmeticbreastaugmentation:suppor-tiveuseofadipose-derivedstem/stromalcellsJ].AestheticPlastSurg,2008,32(1):48-55.SterodimasA,deFariaJ,NicarettaB,etal.Cell-AssistedLipotransfer[J].AesthetSurgJ,2010,30(1):78-82.YoshimuraK,SugaH,EtoH.Adipose-derivedstem/progenitorcells:rolesinadiposetissueremodelingandpotentialuseforsofttissueaugmentation[J].RegenMed,2009,4(2):265-273.AustL,DevlinB,FosterSJ,etal.Yieldofhumanadipose-derivedadultstemcellsfromliposuctionaspirates[J].Cytotherapy,2004,6(1):7-14.SchipperB,MarraKG,RubinJP.Regionalanatomicandageeffectsoncellsfunctionofhumanadipose-derivedstemcells[J].AnnPlastSurg,2008,60(5):538-544.ZUKPA,ZHUM,MIZUNOH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapiesJ].TissueEng,2001,7(2):211-226.KURITAM,MATSUMOTOD,SHIGEURAT,etal.Influencesofcentrifugationoncellsandtissuesinliposuctionaspirates:optimizedcentrifugationforlipotransferandcellisolation[J].PlastR