HER免疫组化检测的质量控制

HER2免疫组化检测的质量控制苏州大学附属第一医院郭凌川1内容提要HER2检测的质量控制和质量保证HER2检测质量的影响因素检测前检测中检测后HER2检测的质量保证内部质保外部质保Ring研究HER2检测的质量控制和质量保证3质量体系－定义 质量控制（QC）用以确保HER2检测结果正确性的内部验证步骤质量保证（QA）通过与其他实验室检测结果相比较而得到的检测技术评价的方式（例如，外部控制）BilousM,etal.ModPath

2003;16:173–182.质量控制与质量保证有何区别？质控达到和/或维持目标质量在检测中每个步骤均进行样品检查，从而决定是否进行相关改进操作步骤的内部验证每批实验都应进行确保每个检测结果均准确质保旨在改善总体检测操作与其他检测中心相比较质控/质保原则（推荐）内部质量控制a)染色

严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤

设立对照组:细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+,2+,3+需经原位杂交确定

若对照组检测未能达标，需重新进行实验b)评分

评价:若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够乳腺癌：仅浸润性肿瘤不均匀:选择代表性区域异质性特异区域:按最高分评分c)实验室

设立适当对照组d)检测步骤

难以确定的检测病例1)重新检测2)将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3)咨询外部实验室e)记录

使用标准化检测报告表

记录任何:与标准化标本处理步骤相违背的不当操作难以确定病理诊断的病例持续质量评价对相关从业人员进行教育培训每年重新检测约5%的阳性和阴性病例参与Ring研究AdaptedbypermissionfromMacmillanPublishersLtd;BilousMetal.ModPathol2003;16:173─182.©2003.质控/质保原则（推荐）内部质量控制a)染色

严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤

设立对照组:细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+,2+,3+，2+需经原位杂交确定

若对照组检测未能达标，需重新进行实验b)评分

评价:若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够胃癌或胃食管交界癌：选择代表性区域不均匀:选择代表性区域异质性特异区域:按最高分评分c)实验室

设立适当对照组d)检测步骤

难以确定的检测病例1)重新检测2)将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3)咨询外部实验室e)记录

使用标准化检测报告表

记录任何:与标准化标本处理步骤相违背的不当操作难以确定病理诊断的病例持续质量评价对相关从业人员进行教育培训每年重新检测约5%的阳性和阴性病例参与Ring研究AdaptedbypermissionfromMacmillanPublishersLtd;BilousMetal.ModPathol2003;16:173─182.©2003.HER2检测质量的影响因素8影响IHC检测结果之常见问题诸多因素会影响IHC结果的评估标本固定较差1

染色不均细胞质染色,IHC02

弥散性非均一性细胞质染色标本点状假阳性染色2

棕色点状染色为胞质染色而非胞膜染色标本边缘假阳性染色1

肿瘤标本边缘染色而中心无染色WHanna供图;

Dako供图.影响FISH检测结果之常见问题标本制备染色步骤固定不完全1片状染色;信号较弱或缺失过分固定1持续性自发性荧光;信号较弱或缺失消化封闭不完全2较强自发性荧光；背景亦呈现较强非特异性染色Abbott供图;2.Ventana供图.取样组织处处理固定方方式检测仪仪器精精准度度实验室室步骤骤固定时时间检测方方法验证证检测人人员抗原修修复类类型实验试试剂对照实验条条件使用图图像分分析判读标准报告内内容评分系系统HER2检测偏偏倚检测后后检测前前检测中中影响HER2检测结结果之之因素素WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118──145.HER2检测的的影响响因素素：检检测前前12影响HER2检测结结果之之因素素:检测前前取样组织处处理固定方方式固定时时间Pre-analyticHER2检测偏偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.检测前前取样原发性性乳腺腺癌最好为为手术术切除除而非非活检检标本本，包包含癌癌旁乳乳腺组组织避免细针穿刺活活检取取样转移性性乳腺腺癌穿刺活活检取取样胃癌经内镜镜活检检取样样或经经手术术切除除之标标本影响HER2检测结果之之因素:检测前取样HER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.检测前HER2检测偏倚影响HER2检测结果之之因素:检测前组织处理方方式提供新鲜及及已定位之标本或切切除后迅速速经甲醛固固定之标本本立即转送至至备检实验验室:尽量缩短从从标本切除除至浸入10%NBF固定之间的的时间，通通常控制在在20–30分钟以内乳腺癌：最最多1小时胃癌：20–30分钟之内从手术切除除到实验室室接收之间间的组织处处理不当会会造成不理理想和不一致的的HER2检测结果–最坏的情况况下，检测测有可能失失败组织处理HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚影响HER2检测结果之之因素:检测前固定时间乳腺癌最少6小时不超过48小时胃癌穿刺活检最最少1小时（以便便充分固定定）比较大的样样本需要至至少8小时不超过48小时固定时间HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚《乳腺癌HER2检测指南（（2009版）》编写组乳乳腺癌HER2检测指南（（2009版）中华病病理学杂2009;38(12):836–840.《胃癌HER2检测指南》编写组胃胃癌HER2检测指南中中华病理理学杂志2011;40(8):553-557.影响HER2检测结果之之因素:检测前固定方式首选10%中性缓冲福福尔马林（（NBF）10%NBF相当于4%甲醛溶液固定方式HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测的影影响因素素：检测测中18影响HER2检测结果之之因素：检测中检测仪器精精准度实验室检测测步骤检测人员抗原修复类类型实验试剂对照实验条件HER2检测偏倚检测中WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.检测方法验验证影响HER2检测结果之之因素：检测中验证检测方方法用于检测之实验验步骤应经经已知实验验结果验证证标准化实验验条件需经经标准化试试验方法验验证后才可可常规应用用HER2检测偏倚检测中检测方法验证WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.影响HER2检测结果之之因素：检测中检测仪器之之精准度应有常规校校准及维护护检测仪器器的相关操操作流程移液器孵育箱水浴锅温度计检测仪器精精准性WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.HER2检测偏倚检测中仪器准确度度指该实验验仪器能正正确显示操操作者的设设定方式－－正确确运作仪器器精精确确度度指指该该实实验验仪仪器器每每次次操操作作都都能能显显示示相相同同的的检检测测结结果果－－可重重复复性性影响响HER2检测测结结果果之之因因素素：检检测测中中实验验室室步步骤骤须经经验验证证之之免免疫疫组组化化实实验验步步骤骤实验验室室步步骤骤HER2检测偏倚检测中WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.影响HER2检测结果之因因素：检测中检测人员相关检测人员员应接受正规规检测技术培培训（包括资格考试）并给予相应应支持定期考评：例例如年度考评检测人员WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145;《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》编写组乳腺腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理理学杂志2009,38(12):836-840HER2检测偏倚检测中影响HER2检测结果之因因素：检测中抗原修复类型型所采用之抗原原修复系统与与现有实验条条件相适应，，并能产生可可重复性结果果抗原修复类型型WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测偏倚检测中相同FISH阴性乳腺癌组织标标本应用相同浓度度抗HER2抗体检测结果果合理抗原修复过度抗原修复假阳性抗原修复对免免疫组化检测测结果很重要要图片由AMorey,StVincent’sHospital,NSW,Australia提供.影响HER2检测结果之因因素：检测中检测试剂所有试剂应确确保其质量稳稳定，经对照照组实验验证证后可使用所有验证应当当记录，签名名和登记日期期检测试剂WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.HER2检测偏倚检测中影响HER2检测结结果之之因素素：检测测中对照对照组组与实实验组组实验验过程程应一一致应使用用已知知实验验结果果的组组织作作为对对照可用已已经验验证的的对照照检测测新抗抗体活活性用于对照的的组织织标本本可自自行制制备或或购买买而得得对照HER2检测偏倚检测中阳性及及阴性性对照照组织标本阳阳性对照组组理想之阳性性对照组,HER2阳性(IHC3+)1WHanna供图;2.LBornstein供图.MDA‑MB‑175,HER2阴性(IHC1+)2对照细胞系系之准备SK-BR-3,HER2阳性(IHC3+)1内部对照设设置患者标本中中肿瘤未累累及部分可可作为内部部阴性对照照组；若阴阴性对照结结果亦出现现染色，则则原肿瘤标标本之染色色结果无效效对照监控如若对照组组未显示预预期结果，，则实验应应重做例如，正常常乳腺上皮膜染色色重复免疫组组化检测WHanna供图.影响HER2检测结果之之因素：检测中检测实验条条件检测应于适当条件下进行温度及湿度度的变化会会影响染色色结果检测条件需需确保得到到可靠且可可重复的HER2检测结果检测条件WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118––145.HER2检测偏倚检测中如何达到高高质量免疫疫组化检测测勿让低年资资实验室技技术人员配配置试剂若试剂未能能正确配制，免疫组化化结果将不不可靠低年资技术术人员应接接收试剂配制训练及上级级指导监督督正确的抗体体稀释可避免免疫组化的的误差记录每次抗抗体稀释的的浓度，每每次登记相相应日期及及时间如遇错误检检测结果，，上述记录录数据可用用来追溯错错误原因完善改进抗抗原修复方方法较耗时但必必须进行设计验证步步骤目的确定经证实实或验证之之相关实验验步骤是否否可于本实实验室可行行确定检测测参数固定检测方法法及条件件试剂及浓浓度操作设定定(若自动化化操作)操作人员员技术能能力样本(检测组)选择25–100个样本用用不同经经证实的的检测方方式进行行检测，，可使用用组织芯芯片请注意:乳腺癌与与胃癌标标本进行行检测验验证应分分开进行行设计验证证步骤记录实验验验证的的每一操操作步骤骤这些记录录可用于于建立实实验室标标准化操操作参考考指南记录所有有操作步步骤若任何一一个步骤骤发生变变化，整整个实验验必须重重做目标：阳阳性及阴阴性实验验验证组组与原实实验结果果达95%的一致性性使用自动动化平台有助助HER2检测标准准化方法抗体单位HER2检测准确性自我评估专家评估自动4B5694.7%95.2%自动A0485390.0%92.0%自动CB11481.0%83.5%手动A0485678.4%85.7%手动CB11981.6%82.0%手动SP3278.0%88.0%如果使用用自动化化检测，必须基基于现有有的经验证的的手动操作方案案PQCC委员会提提供数据据国家质量量控制认认证项目目中自动动与手动动HER2检测方法法对比HER2检测的影影响因素素：检测测后35影响HER2检测结果果之因素素：检测后后图像分析析方法判读标准报告内容容评分系统统HER2检测偏倚倚检测后WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.影响HER2检测结果果之因素素：检测后后检测结果果判读标准及评评分系统统需依国内内/国际HER2检测指南南进行标标准化操操作HER2检测偏倚检测后HER2检测偏倚判读标准评分系统统图像分析析方法IHC检测结果果判读及及评分多数操作作指南推推荐下列列分析免免疫组化化检测结结果的标标准：依细胞染染色百分分比及强强度进行行评分:乳腺癌:全膜染色色评估染色色侵入部部分，但但不包括括原位部部分寻找完整整深染色色及均匀匀的全膜膜区域胃癌：基基底侧膜膜、侧膜膜或完全全性膜染染色分析检测测结果时时，细胞胞质染色色应排除除在外。。若细胞胞质染色色干扰细细胞膜染染色结果果判断时时，应重重新检测测。正常上皮皮细胞不不应有染染色出现现。若出出现染色色，则应应重新检检测。留意待检检标本出出现收缩缩/破损,这些现象象会造成成检测结结果的假假阳性若标本染染色不均均，应依依染色最最强部位位进行评评分根据对照照组实验验结果决决定实验验组检测测结果是是否可信信乳腺癌或或胃癌检检测应使使用其特特异性评评分标准准ISH检测结果果判读及评分所有乳腺腺癌及胃胃癌IHC2+标本均需需再次进进行ISH检测进行行确定分析ISH检测结果果时之注注意事项项：乳腺癌：：依H&E和/或免疫组组化染色色检测结结果来确确定肿瘤瘤的侵及及程度;原位癌不予评评分从浸润性肿瘤瘤的两个不同同区域数细胞胃癌：由于HER2的表达异质性性，必需筛选出整个扩增区域域包括来自于于不同肿瘤领领域的细胞以以提供一个更更加统一的分分析评分标准准Brightfield方法如SISH建议确认HER2扩增重点区域依对照组检测测结果决定实实验组检测结结果是否可信信于两个肿瘤侵及及区域计数至至少20个不重叠的细细胞若信号不均匀匀(>25%)，应重新检测测若检测结果自自发荧光过强强或核清晰度度较差时则应应重新检测若背景干扰信信号辨识时，，应重新检测测(>10%细胞质信号)重复信号作单单一计数影响HER2检测结果之因因素：检测后检测报告检测报告应包包含以下信息息：标本部位及类类型固定液种类标本离体至固固定时间标本固定的时时间抗体检测方法图像分析方法法对照设置HER2检测偏倚检测后HER2检测偏倚报告内容《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》编写组乳腺腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理理学杂2009;38(12):836––840.HER2检测的质量保证理想的质量体系包括括内部质保计划划外部质保计划划参与Ring研究内部质保43内部质保－理理想计划继续进行质控控及检测仪器器维护继续进行实验验室人员技术术训练及能力力测评实验步骤－严严格遵守标准准化操作方案案常规对照组(阳性，阴性及及内部对照组组)；任何对照组组若出现非预期实验结果果，则应重新新检测将检测阳性率率及阴性率与与已发表数据据比较，从而监控检测测质量对病理医生进进行继续教育育及能力测评评(如进行同行检检测能力比较较)继续进行常规规评价及总结结，分析现存问题题，及时弥补补不足外部质保45外部质保内容容美国病理学会会（CAP）认证内容要要求检查时记记录验证检测之方方法检测步骤之使使用检测技术人员员之培训标本及试剂之之正确标记标本及试剂之之正确贮存检测仪器之校校准及质控内部质保计划划及实施依据检测质量检测技术人员员及病理医生生检测能力之之测评检测报告之准准确性及质量量正确提交检测测结果WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.参与外部质保保之益处可证明本实验验室HER2检测结果是否否准确可验证本实验验室检测方法法检测操作较差差之实验室可可得到较多相相关建议及帮帮助本实验室检测测技术及检测测结果判读的困难可得到及及时纠正及弥弥补美国病理医师师学会（CAP）认证（乳腺癌）CAP提供HER2检测认证熟练检测(按照ASCO*/CAPHER2检测指南和认认证列表)质量管理/QC结果报告具有IHC或ISH进行HER2检测条件的CAP认证实验室需需要注册并参参与CAP认可的熟练性性测试实验室表现将将被监测；实验室必须达达到90%或以上的测试试评分（如果果每次测试都都能成功提交交的话）发送HER2切片到其他设设备进行组织织处理和染色色、并将结果果拿回进行判判读的实验室室，必须参与与熟练性测试试*ASCO,美国临床肿瘤瘤医师协会英国国家外部部质量保证评评价计划（乳腺癌）向全球实验室室开放计划针对免疫疫组化及原位位杂交检测参与该计划的的实验室每季季度需对该计计划组织所提提供的细胞系系标本进行免免疫组化检测测，检测结果果将交回该计计划组织送回该计划组组织之检测结结果将由四位位专家进行最最终评分，取取平均分作为为参与实验室室最后得分最终评分结果果有利于相关实验室改改进现有实验验操作技术以以及接受相关技术培训训Ring研究50什么是Ring研究？Ring研究是指几个个不同的检测测中心对同样样的组织样本本进行评估。。评估分几轮轮进行，在每每一轮评估中中，每个检测测中心轮流提提供组织样本本