分子病理基础纲要课件

DepartmentofPathology

SchoolofBasicMedicalSciences

HuangAimin肿瘤的分子病理学基础1DepartmentofPathology肿瘤的分子

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因肿瘤分子病理学研究方法2基因结构的分子病理改变2基因结构分子病理改变的主要类型点突变在基因编码区缺失或插入几个碱基基因序列大片断缺失和插入染色体易位重排基因扩增转录调控异常引起mRNA合成异常转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常3基因结构分子病理改变的主要类型点突变3

1点突变

单个碱基被另一种碱基取代

1)硷基替换致氨基酸改变CTC→CCC

亮→脯氨酸2)终止密码突变,合成比正常长的肽链

TAA→TAC

终止→酪氨酸3)突变形成终止密码,肽链变短TGG→TGA

色氨酸→终止4)密码子改变,氨基酸无改变TCC→TCG

丝氨酸→丝氨酸

错义突变(missense)

无义突变

(nonsense)41点突变单个碱基被另一种碱基取代错义突变2在基因编码区缺失或插入几个碱基

缺失或插入3n个碱基,引起n个氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪丝苏丙→酪丙插入处往后的氨基酸序列完全改变

(Frameshift,移码突变) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙苏→酪丝门冬52在基因编码区缺失或插入几个碱基5

插入后产生终止密码，肽链变短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯门冬丙→脯终止插入后终止密码改变，肽链变长

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮终止→亮酪门冬6插入后产生终止密码，肽链变短63基因序列大片断缺失和插入使功能蛋白缺失或产生异常蛋白视网膜母细胞瘤－Rb基因大片断缺失甲型血友病－Exon14插入2-4Kb片断

73基因序列大片断缺失和插入75基因扩增基因序列拷贝数增多，重复序列增多转录成mRNA增多翻译成的蛋白质增多85基因扩增8

6转录调控异常引起mRNA合成异常

促进子、增强子或其它基因调控因子异常，引起转录增多，进而引起翻译成的蛋白质量增多乳腺癌Her-2基因促进子异常，使Her-2转录增多，蛋白质增多96转录调控异常引起mRNA合成异常97转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常

转录后及翻译调控异常蛋白修饰改变

蛋白质量和质的异常功能蛋白或酶的异常可致细胞转化107转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常10

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因肿瘤分子病理学研究方法

11基因结构的分子病理改变11

肿瘤发生的分子生物学基础原癌基因、癌基因、肿瘤抑制基因对细胞生长、分化起正向或反向调节发生异常改变，可致细胞转化和肿瘤发生肿瘤是细胞中多种基因突变的结果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene12肿瘤发生的分子生物学基础原癌基因、癌基因、肿瘤抑制

癌基因与抑癌基因

肿瘤的发生与癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相关多步骤，涉及多种癌基因和抑癌基因一种肿瘤可有多种基因的变化同一种基因的改变可在不同肿瘤的发生中起作用13癌基因与抑癌基因13原癌基因和癌基因的发现和定义1989年Varmus和Bishop获诺贝尔奖

proto-oncogene存在于正常细胞内，编码促进细胞生长物质的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因编码的蛋白质多为对正常细胞生长十分重要的GF&GFR14原癌基因和癌基因的发现和定义1989年Varmus和

生长因子及生长因子受体

PDGFFGFEGFR

c-sis基因产物是与PDGF相似的蛋白质信号转导蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可产生p21蛋白定位于细胞膜内侧的膜结合蛋白，接收细胞外生长信号，在细胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的产物和正常功能15生长因子及生长因子受体原癌基因的产物和正常功能15细胞周期调节蛋白

CYCD1---细胞周期蛋白

CDK4-----细胞周期蛋白依赖性激酶核调节蛋白(nuclearregulatoryproteins)

转录活化因子

myc、myb、fos

产物为位于细胞核内的蛋白质启动DNA复制过程，使静止期细胞进入细胞周期1616

原癌基因产物17原癌基因产物17基因变异方式和原癌基因活化点突变-----癌基因活化的主要方式DNA扩增---另一主要方式不明原因复制成多拷贝(

Myc---神经母）染色体易位与基因重排---淋巴瘤和白血病

18基因变异方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改变---低甲基化且与点突变、基因缺失、基因表达异常发生有密切关系基因过量表达不适宜的时间和场合表达错误地开启在胚胎时期才有活性的基因细胞癌变的一个重要因素19癌基因甲基化改变---低甲基化19

癌基因与人类肿瘤1Ras基因变异与肿瘤H-rasK-rasN-ras全长约30kb，由4个Exon组成均可产生分子量为21KD的蛋白质---p21由189个氨基酸组成P21具有GTP结合活性，参与信号传递许多癌基因的转化作用可能由ras信号系统介导，故ras异常与肿瘤增殖密切相关20癌基因与人类肿瘤1Ras基因变异与肿瘤20

肿瘤中ras改变基因突变：第12、13、61致瘤性点突变20％肺癌90％胰腺癌80％大肠癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因过度表达乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多21 肿瘤中ras改变21

2)基因扩增

基因序列拷贝数增多神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等与肿瘤进展、浸润、预后、复发有关22223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

产物185KD(P185),与EGFR十分相似肿瘤中---基因扩增与过度表达

引起蛋白增多（免疫组化染色增强）

见于30％以上的人类肿瘤乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌

阳性患者抗肿瘤治疗敏感性低，预后差233c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9号染色体上肿瘤中abl基因改变，主要表现为基因重排，与第22号染色体上的Bcr基因片断形成BCR-ABL融合基因，为费城染色体(ph’)的分子基础

90％慢性粒细胞性白血病

20％急性淋巴细胞性白血病244c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18号染色体

凋亡调节基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％滤泡性淋巴瘤

20％弥漫性大细胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤255Bcl-2基因位于第18号染色体25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神经母、软组织肉瘤

8c-Met基因胃癌腺样结构

9Kit基因胃肠道间质瘤

2626

抑癌基因是指在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生的基因

肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制细胞过度增殖抑制癌基因的活化及表达，或通过使癌基因表达产物失活，对细胞恶性转化负调节

抑癌基因27抑癌基因是指在发生突变、缺失或失活时可抑癌基因27

抑癌基因失活突变、缺失等而失活对细胞生长的负调控作用减弱或消失细胞过度增生且分化不成熟恶性转化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm2328抑癌基因失活突变、缺失等而失活对细胞生长的判定抑癌基因的3个基本标准恶性肿瘤的相应正常组织中该基因须正常表达恶性肿瘤中该基因功能失活或结构改变或表达缺陷将该基因的野生型导入瘤细胞内,可部分或全部改变其恶性表型29判定抑癌基因的3个基本标准恶性肿瘤的相应正常组织中该基抑癌基因突变的基本病变PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein30抑癌基因突变的基本病变Pointmutatio1p53基因

人p53基因为约20kb的DNA片段位于17号染色体，共有11个外显子,转录出约为2.5kb的mRNA编码393个AA组成的53KD核内蛋白质具蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA结合功能被《Science》评为1993年的明星分子

常见的抑癌基因与肿瘤311p53基因常见的抑癌基因与肿瘤31

p53蛋白有5个高度保守区AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-2863232p53是细胞生长周期中的负调节因子细胞周期调控DNA修复细胞分化细胞凋亡33p53是细胞生长周期中的负调节因子33

肿瘤细胞p53基因的改变1)点突变或基因小片断缺失或插入

人肿瘤中最常见的突变（50％－60％）常发生在第5－8Exon，突变热点（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突变相对频率P53基因组DNA结构34 肿瘤细胞p53基因的改变E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)结肠癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌与肝癌GT结肠癌GCAT35Hotspots35

2)蛋白的改变

野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟难以检出基因突变表达突变型p53蛋白时，半衰期增加到数小时,免疫组化可检出p53蛋白突变型p53蛋白，无抑癌功能362)蛋白的改变36

2Rb基因第一个被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中发现，称为Rb基因1986年美国3个实验室分别独立克隆---200kb27Exon，转录产物为4.7kb的mRNAmRNA编码由928AA组成MW105-110KD的核内蛋白，参与细胞周期调控磷酸化与非磷酸化两种形式

372Rb基因37

Rb基因在肿瘤中的改变主要为大片断缺失和基因突变

RB抑癌基因的缺失或突变而导致P105失活视网膜母细胞瘤骨肉瘤……….43%小细胞肺癌….47%乳腺癌……….32%与p53,c-myc,c-fos,TGF相互调节38 383MTS1基因又称p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又称p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因编码p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

393MTS1基因又称p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信号传导adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性结肠多发性息肉病、结肠癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三个实验室同时分离鉴定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)4040

9p63、p73基因DNA序列上与p53基因有很大同源性

10WT1基因肾细胞分化有关Wilms瘤中基因缺失或变异

11NF1基因

神经纤维瘤病易感基因

4141

多步癌变的分子基础分子水平改变正常上皮过度增生

形态学改变早期腺瘤

晚期腺瘤

结肠癌

APC缺失或突变中期腺瘤

DNA甲基化丧失

Ras基因突变

DCC基因缺失

P53基因缺失42多步癌变的分子基础分子水平改变正常上皮过度增生

肿瘤分子病理诊断的意义

肿瘤易感基因病变的诊断

肿瘤的早期诊断与鉴别诊断

疑难肿瘤的诊断及分类

肿瘤病情监测

肿瘤的个体化和预见性治疗

肿瘤的预后判断43肿瘤分子病理诊断的意义43

肿瘤易感基因病变的诊断与遗传相关的肿瘤易感基因检测，筛检肿瘤高危人群已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤

Rb---视网膜母细胞瘤

WT1---肾母细胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神经纤维瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌44肿瘤易感基因病变的诊断与遗传相关的肿瘤易感基因检测，筛检

肿瘤基因标志与肿瘤诊断

较普遍表达

H-rasK-rasc-mycc-fos

特异性表达

abl

临床诊断意义尚不明确

c-mosc-yesc-fpsc-src45肿瘤基因标志与肿瘤诊断45

肿瘤的早期诊断分子病理改变早于细胞形态学改变可能检测出浸润前期的肿瘤K-ras基因突变---12,13,61胰腺癌、结肠癌、肺癌FNA检测胰腺癌第12密码子突变，检出率100％P53蛋白的核内表达为多种恶性肿瘤的表现46肿瘤的早期诊断分子病理改变早于细胞形态学改变46

肿瘤基因标志与肿瘤鉴别诊断erbB：上皮源性肿瘤高表达erbB：肺大细胞癌高表达肺小细胞癌及黑色素瘤低或不表达Fms：粒细胞性白血病高表达淋巴细胞性白血病不表达C-myc激活….B细胞性淋巴瘤L-myc扩增….肺小细胞癌N-myc扩增….神经母细胞瘤47肿瘤基因标志与肿瘤鉴别诊断47

疑难肿瘤的诊断及分类判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T细胞受体（TCR)基因的重排B细胞性淋巴瘤---Ig、

、重链（H)重排T细胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒细胞性白血病----Bcr区基因重排神经母细胞瘤---N-myc扩增与过表达神经细胞瘤------C-myc扩增与过表达48疑难肿瘤的诊断及分类判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其

肿瘤的病情监测N-myc高表达….神经母恶性进展L-myc活性高….肺小细胞癌恶性度高ras高表达………前列腺癌低分化H-ras高表达……胃癌已转移neu高表达……...癌已转移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）49肿瘤的病情监测49

肿瘤的个体化和预见性治疗反义治疗人工合成特异寡核苷酸导入瘤细胞，封闭致癌基因的表达

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr50肿瘤的个体化和预见性治疗50抑癌基因治疗将正常的抑癌基因导入恶变细胞内代替或补偿有缺陷的抑癌基因，抑制肿瘤生长并逆转其表型

已有报道将

RBP53APCNF1P21P16

分别导入多种肿瘤细胞内51抑癌基因治疗51

肿瘤的预后判断P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、结肠癌的预后相关nm23---肿瘤转移抑制基因52肿瘤的预后判断P53p16c-erbB

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因

肿瘤分子病理学研究方法

53基因结构的分子病理改变53

病理学发展的崭新变革对疾病的认识由表型向基因型过渡传统的以形态学为主“旧生物学”病理诊断主要依从于经验

“新生物学”+循证病理学

功能基因组学和蛋白组学为技术平台54病理学发展的崭新变革54

基因多态性检测基因表达谱分析蛋白表达谱分析生物芯片生物信息学bioinformatics成千上万个数据及其相互关联评价分子生物学与病理形态学的整合55基因多态性检测55

肿瘤病理发生学分子诊断和分型，新病种疾病的微生物检测和诊断疾病进展和预后的评估药物反应，指导个体化治疗增加病理学诊断的准确性和权威性实验室研究逐步进入临床应用阶段应用56肿瘤病理发生学应用56

基因芯片技术（genechip/DNAchip）1995年Standford大学医学中心生化系Brown教授首先报道大量靶基因或寡核苷酸片断有序高密度排列在载体上—硅片、玻片、尼龙膜芯片阵列仪激光扫描仪计算机生物信息软件处理系统1基因表达谱分析与肿瘤分子分型P52557基因芯片技术（genechip/DNAchip）1基

表达谱基因芯片基因功能的研究诊断芯片检测芯片遗传病/代谢病/某些肿瘤的诊断病原微生物检测

58表达谱基因芯片58

大规模基因表达谱分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突变检测、新基因寻找抗生素和抗肿瘤药物的筛选疾病的诊断

应用59大规模基因表达谱分析应用59

为肿瘤的精确分型带来希望基因表达谱作为特征性“分子标签”（molecularsignature)建立全新的肿瘤分子诊断和分型系统淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型60为肿瘤的精确分型带来希望60

实验材料要求新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA外周血和培养细胞样本的研究较容易对实体瘤的研究受到一定限制61实验材料要求61

组织微阵列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

数十至数百个小组织排列于载体上形成的微缩组织切片组织筛选和定位阵列蜡块制作和切片2组织芯片技术62组织微阵列(tissuemicroarray,TMA体积小，信息量大，可根据要求进行组合高效快速低消耗地进行各种原位组织学观察研究形态学、免疫组化、原位杂交、原位PCR较好的内对照及实验条件可比性和重复性63体积小，信息量大，可根据要求进行组合63单独或与基因芯片配套用于基因及其蛋白产物的分析和基因功能的研究基因探针的筛选及生物制剂的鉴定组织学、病理学实习教材外科病理缩微图谱64单独或与基因芯片配套用于基因及其64

直接法---荧光素直接标记已知的DNA探针间接法---非荧光标记物标记已知探针桥连一个荧光标记的抗体DNA-DNA杂交DNA-RNA杂交间期细胞分裂中期染色体冷冻切片石蜡切片

3荧光原位杂交---FluorescenceISH,FISH653荧光原位杂交---FluorescenceISH,

重复序列探针位点特异性探针全染色体探针大量商品化的荧光标记探针FISH广泛应用成为可能66重复序列探针66

FDA批准FISH检测HER2/c-erbB2实验目的

评价预后基于阿霉素的化疗选择

帮助评价是否采取曲妥珠单抗(Herceptin,赫赛汀）治疗IHC2+/3+患者，仅FISH阳性者对药物有反应67FDA批准FISH检测HER2/c-erbB267

FISH的应用

乳腺癌HER2基因诊断肺癌EGFR和HER2基因诊断膀胱癌无创性早期诊断和复发的早期检测胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等肿瘤基因的分析研究68FISH的应用682001年12月31日,美国FDA批准FISH检测HER2基因状态用于乳腺癌诊断,以指导临床治疗HER2基因为红色荧光，正常HER2拷贝数(1~5)CEP17为17号染色体着丝粒,为绿色荧光692001年12月31日,美国FDA批准FISH检测HER2

常规PCR是基因检测的金标准基因突变检测、测序的前期和基础易受污染妨碍其临床应用4即时荧光定量PCR---Real-timePCR70常规PCR是基因检测的金标准4即时荧光定量PCR---R

Real-timePCR

灵敏、定量、特异、封闭无污染提供了对PCR产物积累过程实时监测微生物病原检测、肿瘤生物学标志物临床应用前景宽广将逐渐成为病理学必备技术之一71Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子细胞遗传学技术单一的一次杂交检测某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化

5比较基因组杂交72comparativegenomichybridiza

CGH的优点

实验所需样本DNA量较少外周血、培养细胞、新鲜组织、存档组织全基因组范围内分析肿瘤染色体不平衡发现癌基因和抑癌基因所在区域肿瘤发病的分子机制研究73CGH的优点实验所需样本DNA量较少73

CGH的局限性

所能检测到的最小的DNA扩增或丢失在3-5Mb，对于低水平的DNA扩增和小片断丢失可能漏检相关染色体拷贝数无变化时，不能检测出平行染色体的易位74CGH的局限性所能检测到的最小的DNA扩增或丢失在3

lasercapturemicrodissection，LCM从组织切片或细胞涂片上的任一区域切割数百、数十、单个细胞再进行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷冻切片、石蜡切片、细胞涂片先常规或免疫组化染色进行定位

6激光捕获显微切割术75lasercapturemicrodi

局限性

手工操作技术难度大LCM操作简便，耗时少，取材准确需特殊设备，激光器造价高76局限性手工操作技术难度大76

Laserscanningconfocalmicroscope

---LSCM

光学显微镜＋激光扫描＋计算机图像处理细胞CT，显微CT，三维图像重建活细胞长时间无损伤动态观察……

原位---动态---定量

7激光扫描共聚焦显微术77Laserscanningconfocalmicro

细胞间通讯，膜流动性测定细胞骨架的构成培养细胞样本，冷冻切片石蜡包埋标本不合适免疫荧光染色或FISH78细胞间通讯，膜流动性测定78精密、准确、快速、分辨高

快速准确测定细胞内DNA含量和倍体数快速进行细胞分选和细胞收集测定生长分数，诊断恶性肿瘤的参考反映恶性程度和生物学行为8流式细胞术---Flowcytometry，FCM79精密、准确、快速、分辨高8流式细胞术---Flow

在基础研究和临床中的应用

外周血细胞的免疫表型测定和定量分析某一特定细胞群的筛选和收集细胞MDR基因的检测细胞凋亡的定量研究癌基因和抑癌基因的检测细胞内某些蛋白质与核酸的定量分析80在基础研究和临床中的应用外周血细胞的免疫表型测定和定

定量核形态参数的测定

直径/周长/面积/体积

区别良恶性肿瘤、癌前病变与癌肿瘤的组织病理分级、预后判断DNA倍体分析和显色反应的定量

免疫组化原位杂交

9图像分析技术---Imageanalysis

，IA81定量81

杂合性缺失（LOH）检测

单核苷酸多态性（SNP)分析

RNA干扰

8282核酸杂交Southern杂交---检测DNA

Northern杂交---检测RNADot/Slot杂交---检测DNA或RNA

原位杂交(Insituhybridization,ISH)应用范围广DNA和mRNA定性、定位、定量、分布杂交电镜的亚细胞定位

10其他常用技术83核酸杂交10其他常用技术83

restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP

分析

限制性内切酶片断长度多态性分析GenomicDNA酶切电泳转膜杂交放射自显影分析基因的变化结合PCR--PCR-RFLP简便快速样本用量少8484

限制性内切酶酶切位点EcoRI

GAATTC

BamH1

GGATCC

CTTAAG

CCTAGG

GTTAGAATTCGAATCCGAGGTTGGATCCCGG

CAATCTTAAGCTTAGGCTCCAACCTAGGGCC8585

WesternBlot

PCR技术

PCR-RFLP分析

PCR-SSCPDNA单链构象多态性分析

PCR-DNAsequencing

凋亡的检测

计算机重构蛋白质三维结构86WesternBlot86PCR….酶切….电泳

M

正常

突变GAATTCGCATT失去酶切位点野生型突变型PCR产物PCR-RFLP87GAATTCGCATT失去酶切位点野生型突变型PCR产生物信息学技术---bioinformatics

以基因组DNA序列的信息分析为源头分析基因组结构，寻找或发现新基因分析基因调控信息在此基础上研究基因的功能88生物信息学技术---bioinformatics以基因组D

模拟和预测蛋白质空间结构蛋白质的性质、结构及功能间的关系为基于靶分子结构的药物分子设计和蛋白质分子改性设计提供依据已在理论生物学领域占据核心地位主要任务是研究生物分子数据的获取、存储和查询，发展数据分析方法89模拟和预测蛋白质空间结构89生物信息的收集、存储、管理与提供分子生物学的三大核心数据库GenBank核酸序列数据库SWISS-PROT蛋白质序列数据库PDB生物大分子结构数据库已成为全世界分子生物学和医学研究人员获取生物分子序列、结构信息的基本来源发表自己序列或结构测定结果的重要媒体90生物信息的收集、存储、管理与提供分子生物学的三大核心数据库9基因组序列分析基因表达数据的分析与处理了解基因与疾病的关系疾病产生的机制，为疾病的诊疗提供依据确定新药的作用靶点和作用方式设计新的药物分子生物学数据的处理和分析91基因组序列分析生物学数据的处理和分析91开发研制管理分析数据的新工具和实用软件，为生物信息学的具体应用服务与大规模基因表达谱分析相关算法和软件基因表达调控网络的研究与基因组信息相关的核酸、蛋白质空间结构的预测和模拟蛋白质功能预测的研究生物学数据的有效利用92生物学数据的有效利用92现代生物技术的进展生物芯片技术蛋白质二维凝胶电泳技术质谱技术、蛋白质结构测定技术新形式的生物学实验数据的信息挖掘已纳入生物信息学的研究范畴后基因组时代的生物信息学技术将为基因组功能预测、透视基因相互作用及其机制、生物学虚拟实验模型的构建等提供强大支撑93现代生物技术的进展生物芯片技术93生物分子信息处理流程

实验数据信息知识基因工程蛋白质设计疾病诊断疾病治疗新药开发94生物分子信息处理流程数据信息知识基因工程94

极大丰富了判断预后、预测因素的生物学标志物内容不断涌现新的疾病单位、病理分子分型使感染性疾病的微生物学检测和诊断特异、敏感、易行，与组织学检查同步增加病理诊断的准确性和权威性

分子诊断进入病理诊断领域95极大丰富了判断预后、预测因素的生物分子诊断进入病理诊断

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HuangAimin肿瘤的分子病理学基础96DepartmentofPathology肿瘤的分子

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因肿瘤分子病理学研究方法97基因结构的分子病理改变2基因结构分子病理改变的主要类型点突变在基因编码区缺失或插入几个碱基基因序列大片断缺失和插入染色体易位重排基因扩增转录调控异常引起mRNA合成异常转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常98基因结构分子病理改变的主要类型点突变3

1点突变

单个碱基被另一种碱基取代

1)硷基替换致氨基酸改变CTC→CCC

亮→脯氨酸2)终止密码突变,合成比正常长的肽链

TAA→TAC

终止→酪氨酸3)突变形成终止密码,肽链变短TGG→TGA

色氨酸→终止4)密码子改变,氨基酸无改变TCC→TCG

丝氨酸→丝氨酸

错义突变(missense)

无义突变

(nonsense)991点突变单个碱基被另一种碱基取代错义突变2在基因编码区缺失或插入几个碱基

缺失或插入3n个碱基,引起n个氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪丝苏丙→酪丙插入处往后的氨基酸序列完全改变

(Frameshift,移码突变) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙苏→酪丝门冬1002在基因编码区缺失或插入几个碱基5

插入后产生终止密码，肽链变短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯门冬丙→脯终止插入后终止密码改变，肽链变长

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮终止→亮酪门冬101插入后产生终止密码，肽链变短63基因序列大片断缺失和插入使功能蛋白缺失或产生异常蛋白视网膜母细胞瘤－Rb基因大片断缺失甲型血友病－Exon14插入2-4Kb片断

1023基因序列大片断缺失和插入75基因扩增基因序列拷贝数增多，重复序列增多转录成mRNA增多翻译成的蛋白质增多1035基因扩增8

6转录调控异常引起mRNA合成异常

促进子、增强子或其它基因调控因子异常，引起转录增多，进而引起翻译成的蛋白质量增多乳腺癌Her-2基因促进子异常，使Her-2转录增多，蛋白质增多1046转录调控异常引起mRNA合成异常97转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常

转录后及翻译调控异常蛋白修饰改变

蛋白质量和质的异常功能蛋白或酶的异常可致细胞转化1057转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常10

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因肿瘤分子病理学研究方法

106基因结构的分子病理改变11

肿瘤发生的分子生物学基础原癌基因、癌基因、肿瘤抑制基因对细胞生长、分化起正向或反向调节发生异常改变，可致细胞转化和肿瘤发生肿瘤是细胞中多种基因突变的结果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene107肿瘤发生的分子生物学基础原癌基因、癌基因、肿瘤抑制

癌基因与抑癌基因

肿瘤的发生与癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相关多步骤，涉及多种癌基因和抑癌基因一种肿瘤可有多种基因的变化同一种基因的改变可在不同肿瘤的发生中起作用108癌基因与抑癌基因13原癌基因和癌基因的发现和定义1989年Varmus和Bishop获诺贝尔奖

proto-oncogene存在于正常细胞内，编码促进细胞生长物质的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因编码的蛋白质多为对正常细胞生长十分重要的GF&GFR109原癌基因和癌基因的发现和定义1989年Varmus和

生长因子及生长因子受体

PDGFFGFEGFR

c-sis基因产物是与PDGF相似的蛋白质信号转导蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可产生p21蛋白定位于细胞膜内侧的膜结合蛋白，接收细胞外生长信号，在细胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的产物和正常功能110生长因子及生长因子受体原癌基因的产物和正常功能15细胞周期调节蛋白

CYCD1---细胞周期蛋白

CDK4-----细胞周期蛋白依赖性激酶核调节蛋白(nuclearregulatoryproteins)

转录活化因子

myc、myb、fos

产物为位于细胞核内的蛋白质启动DNA复制过程，使静止期细胞进入细胞周期11116

原癌基因产物112原癌基因产物17基因变异方式和原癌基因活化点突变-----癌基因活化的主要方式DNA扩增---另一主要方式不明原因复制成多拷贝(

Myc---神经母）染色体易位与基因重排---淋巴瘤和白血病

113基因变异方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改变---低甲基化且与点突变、基因缺失、基因表达异常发生有密切关系基因过量表达不适宜的时间和场合表达错误地开启在胚胎时期才有活性的基因细胞癌变的一个重要因素114癌基因甲基化改变---低甲基化19

癌基因与人类肿瘤1Ras基因变异与肿瘤H-rasK-rasN-ras全长约30kb，由4个Exon组成均可产生分子量为21KD的蛋白质---p21由189个氨基酸组成P21具有GTP结合活性，参与信号传递许多癌基因的转化作用可能由ras信号系统介导，故ras异常与肿瘤增殖密切相关115癌基因与人类肿瘤1Ras基因变异与肿瘤20

肿瘤中ras改变基因突变：第12、13、61致瘤性点突变20％肺癌90％胰腺癌80％大肠癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因过度表达乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多116 肿瘤中ras改变21

2)基因扩增

基因序列拷贝数增多神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等与肿瘤进展、浸润、预后、复发有关117223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

产物185KD(P185),与EGFR十分相似肿瘤中---基因扩增与过度表达

引起蛋白增多（免疫组化染色增强）

见于30％以上的人类肿瘤乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌

阳性患者抗肿瘤治疗敏感性低，预后差1183c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9号染色体上肿瘤中abl基因改变，主要表现为基因重排，与第22号染色体上的Bcr基因片断形成BCR-ABL融合基因，为费城染色体(ph’)的分子基础

90％慢性粒细胞性白血病

20％急性淋巴细胞性白血病1194c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18号染色体

凋亡调节基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％滤泡性淋巴瘤

20％弥漫性大细胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤1205Bcl-2基因位于第18号染色体25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神经母、软组织肉瘤

8c-Met基因胃癌腺样结构

9Kit基因胃肠道间质瘤

12126

抑癌基因是指在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生的基因

肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制细胞过度增殖抑制癌基因的活化及表达，或通过使癌基因表达产物失活，对细胞恶性转化负调节

抑癌基因122抑癌基因是指在发生突变、缺失或失活时可抑癌基因27

抑癌基因失活突变、缺失等而失活对细胞生长的负调控作用减弱或消失细胞过度增生且分化不成熟恶性转化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm23123抑癌基因失活突变、缺失等而失活对细胞生长的判定抑癌基因的3个基本标准恶性肿瘤的相应正常组织中该基因须正常表达恶性肿瘤中该基因功能失活或结构改变或表达缺陷将该基因的野生型导入瘤细胞内,可部分或全部改变其恶性表型124判定抑癌基因的3个基本标准恶性肿瘤的相应正常组织中该基抑癌基因突变的基本病变PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein125抑癌基因突变的基本病变Pointmutatio1p53基因

人p53基因为约20kb的DNA片段位于17号染色体，共有11个外显子,转录出约为2.5kb的mRNA编码393个AA组成的53KD核内蛋白质具蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA结合功能被《Science》评为1993年的明星分子

常见的抑癌基因与肿瘤1261p53基因常见的抑癌基因与肿瘤31

p53蛋白有5个高度保守区AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-28612732p53是细胞生长周期中的负调节因子细胞周期调控DNA修复细胞分化细胞凋亡128p53是细胞生长周期中的负调节因子33

肿瘤细胞p53基因的改变1)点突变或基因小片断缺失或插入

人肿瘤中最常见的突变（50％－60％）常发生在第5－8Exon，突变热点（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突变相对频率P53基因组DNA结构129 肿瘤细胞p53基因的改变E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)结肠癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌与肝癌GT结肠癌GCAT130Hotspots35

2)蛋白的改变

野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟难以检出基因突变表达突变型p53蛋白时，半衰期增加到数小时,免疫组化可检出p53蛋白突变型p53蛋白，无抑癌功能1312)蛋白的改变36

2Rb基因第一个被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中发现，称为Rb基因1986年美国3个实验室分别独立克隆---200kb27Exon，转录产物为4.7kb的mRNAmRNA编码由928AA组成MW105-110KD的核内蛋白，参与细胞周期调控磷酸化与非磷酸化两种形式

1322Rb基因37

Rb基因在肿瘤中的改变主要为大片断缺失和基因突变

RB抑癌基因的缺失或突变而导致P105失活视网膜母细胞瘤骨肉瘤……….43%小细胞肺癌….47%乳腺癌……….32%与p53,c-myc,c-fos,TGF相互调节133 383MTS1基因又称p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又称p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因编码p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

1343MTS1基因又称p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信号传导adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性结肠多发性息肉病、结肠癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三个实验室同时分离鉴定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)13540

9p63、p73基因DNA序列上与p53基因有很大同源性

10WT1基因肾细胞分化有关Wilms瘤中基因缺失或变异

11NF1基因

神经纤维瘤病易感基因

13641

多步癌变的分子基础分子水平改变正常上皮过度增生

形态学改变早期腺瘤

晚期腺瘤

结肠癌

APC缺失或突变中期腺瘤

DNA甲基化丧失

Ras基因突变

DCC基因缺失

P53基因缺失137多步癌变的分子基础分子水平改变正常上皮过度增生

肿瘤分子病理诊断的意义

肿瘤易感基因病变的诊断

肿瘤的早期诊断与鉴别诊断

疑难肿瘤的诊断及分类

肿瘤病情监测

肿瘤的个体化和预见性治疗

肿瘤的预后判断138肿瘤分子病理诊断的意义43

肿瘤易感基因病变的诊断与遗传相关的肿瘤易感基因检测，筛检肿瘤高危人群已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤

Rb---视网膜母细胞瘤

WT1---肾母细胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神经纤维瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌139肿瘤易感基因病变的诊断与遗传相关的肿瘤易感基因检测，筛检

肿瘤基因标志与肿瘤诊断

较普遍表达

H-rasK-rasc-mycc-fos

特异性表达

abl

临床诊断意义尚不明确

c-mosc-yesc-fpsc-src140肿瘤基因标志与肿瘤诊断45

肿瘤的早期诊断分子病理改变早于细胞形态学改变可能检测出浸润前期的肿瘤K-ras基因突变---12,13,61胰腺癌、结肠癌、肺癌FNA检测胰腺癌第12密码子突变，检出率100％P53蛋白的核内表达为多种恶性肿瘤的表现141肿瘤的早期诊断分子病理改变早于细胞形态学改变46

肿瘤基因标志与肿瘤鉴别诊断erbB：上皮源性肿瘤高表达erbB：肺大细胞癌高表达肺小细胞癌及黑色素瘤低或不表达Fms：粒细胞性白血病高表达淋巴细胞性白血病不表达C-myc激活….B细胞性淋巴瘤L-myc扩增….肺小细胞癌N-myc扩增….神经母细胞瘤142肿瘤基因标志与肿瘤鉴别诊断47

疑难肿瘤的诊断及分类判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T细胞受体（TCR)基因的重排B细胞性淋巴瘤---Ig、

、重链（H)重排T细胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒细胞性白血病----Bcr区基因重排神经母细胞瘤---N-myc扩增与过表达神经细胞瘤------C-myc扩增与过表达143疑难肿瘤的诊断及分类判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其

肿瘤的病情监测N-myc高表达….神经母恶性进展L-myc活性高….肺小细胞癌恶性度高ras高表达………前列腺癌低分化H-ras高表达……胃癌已转移neu高表达……...癌已转移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）144肿瘤的病情监测49

肿瘤的个体化和预见性治疗反义治疗人工合成特异寡核苷酸导入瘤细胞，封闭致癌基因的表达

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr145肿瘤的个体化和预见性治疗50抑癌基因治疗将正常的抑癌基因导入恶变细胞内代替或补偿有缺陷的抑癌基因，抑制肿瘤生长并逆转其表型

已有报道将

RBP53APCNF1P21P16

分别导入多种肿瘤细胞内146抑癌基因治疗51

肿瘤的预后判断P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、结肠癌的预后相关nm23---肿瘤转移抑制基因147肿瘤的预后判断P53p16c-erbB

基因结构的分子病理改变

癌基因与抑癌基因

肿瘤分子病理学研究方法

148基因结构的分子病理改变53

病理学发展的崭新变革对疾病的认识由表型向基因型过渡传统的以形态学为主“旧生物学”病理诊断主要依从于经验

“新生物学”+循证病理学

功能基因组学和蛋白组学为技术平台149病理学发展的崭新变革54

基因多态性检测基因表达谱分析蛋白表达谱分析生物芯片生物信息学bioinformatics成千上万个数据及其相互关联评价分子生物学与病理形态学的整合150基因多态性检测55

肿瘤病理发生学分子诊断和分型，新病种疾病的微生物检测和诊断疾病进展和预后的评估药物反应，指导个体化治疗增加病理学诊断的准确性和权威性实验室研究逐步进入临床应用阶段应用151肿瘤病理发生学应用56

基因芯片技术（genechip/DNAchip）1995年Standford大学医学中心生化系Brown教授首先报道大量靶基因或寡核苷酸片断有序高密度排列在载体上—硅片、玻片、尼龙膜芯片阵列仪激光扫描仪计算机生物信息软件处理系统1基因表达谱分析与肿瘤分子分型P525152基因芯片技术（genechip/DNAchip）1基

表达谱基因芯片基因功能的研究诊断芯片检测芯片遗传病/代谢病/某些肿瘤的诊断病原微生物检测

153表达谱基因芯片58

大规模基因表达谱分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突变检测、新基因寻找抗生素和抗肿瘤药物的筛选疾病的诊断

应用154大规模基因表达谱分析应用59

为肿瘤的精确分型带来希望基因表达谱作为特征性“分子标签”（molecularsignature)建立全新的肿瘤分子诊断和分型系统淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型155为肿瘤的精确分型带来希望60

实验材料要求新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA外周血和培养细胞样本的研究较容易对实体瘤的研究受到一定限制156实验材料要求61

组织微阵列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

数十至数百个小组织排列于载体上形成的微缩组织切片组织筛选和定位阵列蜡块制作和切片2组织芯片技术157组织微阵列(tissuemicroarray,TMA体积小，信息量大，可根据要求进行组合高效快速低消耗地进行各种原位组织学观察研究形态学、免疫组化、原位杂交、原位PCR较好的内对照及实验条件可比性和重复性158体积小，信息量大，可根据要求进行组合63单独或与基因芯片配套用于基因及其蛋白产物的分析和基因功能的研究基因探针的筛选及生物制剂的鉴定组织学、病理学实习教材外科病理缩微图谱159单独或与基因芯片配套用于基因及其64

直接法---荧光素直接标记已知的DNA探针间接法---非荧光标记物标记已知探针桥连一个荧光标记的抗体DNA-DNA杂交DNA-RNA杂交间期细胞分裂中期染色体冷冻切片石蜡切片

3荧光原位杂交---FluorescenceISH,FISH1603荧光原位杂交---FluorescenceISH,

重复序列探针位点特异性探针全染色体探针大量商品化的荧光标记探针FISH广泛应用成为可能161重复序列探针66

FDA批准FISH检测HER2/c-erbB2实验目的

评价预后基于阿霉素的化疗选择

帮助评价是否采取曲妥珠单抗(Herceptin,赫赛汀）治疗IHC2+/3+患者，仅FISH阳性者对药物有反应162FDA批准FISH检测HER2/c-erbB267

FISH的应用

乳腺癌HER2基因诊断肺癌EGFR和HER2基因诊断膀胱癌无创性早期诊断和复发的早期检测胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等肿瘤基因的分析研究163FISH的应用682001年12月31日,美国FDA批准FISH检测HER2基因状态用于乳腺癌诊断,以指导临床治疗HER2基因为红色荧光，正常HER2拷贝数(1~5)CEP17为17号染色体着丝粒,为绿色荧光1642001年12月31日,美国FDA批准FISH检测HER2

常规PCR是基因检测的金标准基因突变检测、测序的前期和基础易受污染妨碍其临床应用4即时荧光定量PCR---Real-timePCR165常规PCR是基因检测的金标准4即时荧光定量PCR---R

Real-timePCR

灵敏、定量、特异、封闭无污染提供了对PCR产物积累过程实时监测微生物病原检测、肿瘤生物学标志物临床应用前景宽广将逐渐成为病理学必备技术之一166Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子细胞遗传学技术单一的一次杂交检测某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化

5比较基因组杂交167comparativegenomichybridiza

CGH的优点

实验所需样本DNA量较少外周血、培养细胞、新鲜组织、存档组织全基因组范围内分析肿瘤染色体不平衡发现癌基因和抑癌基因所在区域肿瘤发病的分子机制研究168CGH的优点实验所需样本DNA量较少73

CGH的局限性

所能检测到的最小的DNA扩增或丢失在3-5Mb，对于低水平的DNA扩增和小片断丢失可能漏检相关染色体拷贝数无变化时，不能检测出平行染色体的易位169CGH的局限性所能检测到的最小的DNA扩增或丢失在3

lasercapturemicrodissection，LCM从组织切片或细胞涂片上的任一区域切割数百、数十、单个细胞再进行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷冻切片、石蜡切片、细胞涂片先常规或免疫组化染色进行定位

6激光捕获显微切割术170lasercapturemicrodi