第六章分子发光分析课件

(MolecularLuminescenceAnalysis)第6章分子发光分析法(MolecularLuminescenceAnalys1第6章红外吸收光谱法6.1荧光分析法6.2磷光分析法6.3化学发光分析法MolecularFluorescenceAnalysisMolecularphosphorescenceAnalysis第6章红外吸收光谱法6.1荧光分析法6.22

分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。

发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能3MolecularFluorescenceAnalysis

一、概述

分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。6.1荧光分法MolecularFluorescenceAnalysi4分子发光光谱

分子发光光谱包括荧光光谱、磷光光谱和化学发光光谱。

荧光和磷光为光致发光，是物质的基态分子吸收一定波长范围的光辐射激发至单重激发态，当其由激发态回到基态时产生的二次辐射。

荧光由单重激发态向基态跃迁产生。

磷光由单重激发态先过渡到三重激发态，然后由三重激发态向基态跃迁向基态跃迁产生。

化学发光是化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射。分子发光光谱5当n,L,S三个量子数确定之后，原子能级就基本确定了。用n、L、S三个量子数描述原子能级的光谱项（n2S+1L）。L与S相互作用，可产生2S+1个能级稍微不同的分裂，是产生光谱多重线的原因。M=2S+1叫做谱线的多重性。习惯上将多重性为1、2、3的光谱项分别称为单重态、双重态、三重态。光谱项与光谱支项当n,L,S三个量子数确定之后，原子能级就基本确定了。光6荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。比UV-Vis的灵敏度高得多。

选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。荧光分析的特点：7紫外可见分光光度法的特点(一)灵敏度高

吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1~10-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-4~10-5%的痕量组分。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。紫外可见分光光度法的特点(一)灵敏度高吸光8二、基本原理

(一)分子荧光的产生

处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。二、基本原理9

根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任意两个能级之间进行，而必须遵循一定的“选择定则”，这个定则是①△L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但当J=0时，△J=0的跃迁是不允许的。不符合光谱选择定则的跃迁叫禁戒跃迁。若两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子具有较长的寿命，原子的这种状态称为亚稳态。光谱选择定则根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任意两个10基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。三重态能级低于单重态(Hund规则)图6.1分子内的光物理过程基态：电子自旋配对，激发单重态：分子吸收能激发三重态：分子吸11

处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。（二）去活化过程(Deactivation)

处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射121)振动弛豫(VibrationalRelaxation，VR)

在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。1)振动弛豫13荧光、磷光能级图

→振动弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。荧光、磷光能级图142)内转化(

InternalConversion，IC)

对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。2)内转化15S0S1S2T1吸光1吸光2内转移荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2内转移荧光、磷光能级图163)荧光发射

处于第一激发单重态(S1)的电子跃迁至基态各振动能级(S0)时，将得到最大波长为3的荧光。

注意：

基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，3的波长较激发波长1或2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。3)荧光发射17荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3荧光荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光184)系间窜跃

指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。

有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。4)系间窜跃19荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3系间窜跃荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光205)外转换(ExternalConversion，EC)

受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。5)外转换21第六章分子发光分析课件22S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸发发系间窜越内转换振动弛豫能l2l1l23（三）荧光效率及其影响因素

荧光量子产率(荧光效率或量子效率)，它表示物质发射荧光的能力，常用下式表示。或=发射荧光量子数/吸收荧光量子数。

在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。（三）荧光效率及其影响因素荧光量子产率(荧24若用数学式来表达这些关系，得到

=kf

/(kf+ki)

式中:

kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和。

凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。

实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明ki很小，可以忽略不计。

一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似。若用数学式来表达这些关系，得到25

分子产生荧光必须具备两个条件：

①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。分子产生荧光必须具备两个条件：26(1)跃迁类型

对于大多数荧光物质：

首先，经历或n激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光(较大)。这是由于跃迁具有较大的(一般比n大100-1000倍)。(1)跃迁类型27其次，跃迁的寿命约为10-7~10-9s，比n跃迁的寿命10-5—10-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小。(S1T1能级差较大)，这也有利于荧光的发射。

总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。其次，跃迁的寿命约为10-7~10-928(2)共轭效应

容易实现激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭体系化合物除外)。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。

例如：在多烯结构中，Ph(CH=CH)3Ph和Ph(CH=CH)2Ph在苯中的分别为0.68和0.28。

共轭效应使荧光增强的原因：

主要是由于增大荧光物质的

，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。(2)共轭效应29(3)刚性平面结构

多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。(3)刚性平面结构30(4)取代基效应

芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-CO、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。(4)取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代31

卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。

取代基的空间障碍对荧光也有影响。

立体异构现象对荧光强度有显著的影响。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可32四、金属螯合物的荧光

除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。四、金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子33(1)螯合物中配位体的发光

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。

如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。(2)螯合物中金属离子的特征荧光

这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd*跃迁和ff*跃迁，最终发射的是dd*跃迁和ff*跃迁光谱。(1)螯合物中配位体的发光34353535例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体例1，2-二苯乙烯反式：平面构型36不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92萘VAF37五、影响荧光强度的因素(环境因素）①溶剂对荧光强度的影响

溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。

一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。五、影响荧光强度的因素(环境因素）38

一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极性，将使n跃迁的能量增大，跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于39

但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。

如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电力状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物40②温度对荧光强度的影响

温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。②温度对荧光强度的影响41③溶液pH值对荧光强度的影响

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。

具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。

对于金属离子与有机试剂形成的发光螯合物，一方面pH会影响合螯物的形成，另一方面还会影响螯合物的组成，从而影响它们的荧光性质。③溶液pH值对荧光强度的影响42④内滤光作用和自吸收现象

溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。

内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。

在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。④内滤光作用和自吸收现象43

⑤顺磁性物质的存在，使激发单重态的体系间窜越速率增大，因而会使荧光效率降低。⑤顺磁性物质的存在，使激发单重态的体系间窜越442、影响荧光强度的环境因素因素溶剂一般溶剂效应折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同温度温度上升使荧光强度下降内部能量转化作用增大碰撞频率增加，使外转换的几率增加酸度化合物所处状态不同电子构型上有所不同荧光强度和荧光光谱不同2、影响荧光强度的环境因素因素溶剂一般溶剂效应折射率和介电45464646第六章分子发光分析课件47（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系根据荧光强度的定义式：=If/Ia

荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率(荧光量子效率)。

If=Ia=f（I0-I）Ia：吸收的辐射强度I0：入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A将上式展开（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系根据荧光强度的定义式：48

在荧光浓度很稀(A<0.05)时，方括号中除第一项之外的其他项均可忽略，可得：

If=2.3I0A

=2.3I0bc

当入射光强度I0和激发光一定时，上式为：

If=Kc

即，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当A0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。荧光定量分析依据在荧光浓度很稀(A<0.05)时，方括号中49荧光猝灭

荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率f下降称为荧光猝灭。

使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。碰撞猝灭——是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式跃迁，荧光效率降低。

M+激→M*M*+Q→M+Q+热自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。荧光猝灭50

任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧(磷)光定性分析的基础。1)激发光谱

改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到荧光激发光谱。

激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。(四)荧光激发光谱与发射光谱任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与51

激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。

2)发射光谱

发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。

由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。

激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选52图6.2荧光发射光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱图6.2荧光发射光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱53光源氙灯和高压汞灯激发单色器光栅扫描激发光谱，选择激发波长液槽I0

IIf发射单色器扫描发射光谱消除其它光线的干扰，获得所需的荧光检测器显示器光电倍增管三、荧光分析仪器与分光光度计有两点不同

①两个单色器②检测器与激发光互成直角光源氙灯和高压汞灯激发单色器光栅扫描激发光谱，选择激发波长液541、光源

激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽

荧光计中，常使用卤钨灯作光源

荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1、光源激发光源一般要求比吸收测量中552、单色器

荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱

大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。

第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex，用此激发光激发液池内的荧光物质ex。

第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长em。在选定的em下测定荧光强度，定量分析。2、单色器荧光计用滤光片作单色器，荧光计只563、液槽（样品池）

盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器

把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度。荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度。5、读出装置（显示器）

记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱。3、液槽（样品池）盛放测定溶液，通常是石英材料的57(一)无机化合物的分析

大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强，其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态，发荧光者甚少。但很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物，利用这一性质可对其进行荧光测定。

能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。四、荧光分析法的应用(一)无机化合物的分析大多数无机离子与溶剂之间58

另一类络合物是三元离子缔合物。

罗明丹B为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等阳离子首先与Cl-、Br-等X-形成二元络阴离子，再与罗明丹B缔合成荧光化合物。

署红为阴离子染料，Ag+与邻菲咯啉形成二元络阳离子，再与署红缔合后可使其荧光猝灭，由荧光降低的程度也可对Ag+进行分析。另一类络合物是三元离子缔合物。59(二)有机化合物的分析

脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析，如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.1~2µg•mL⁻¹的丙三醇。

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。(二)有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子60激发光谱和荧光光谱荧光强度I波长

(nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱ex,maxfl,max激发光谱和荧光光谱荧光强度波长(nm)30040050061可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光62三维荧光光谱IF

∝f(ex、em)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长三维荧光光谱IF∝f(ex、em)蒽的激发光63IF

∝f(

ex、em)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长IF∝f(ex、em)蒽的发射光谱固定激发波长、64蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图65蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱66一、概述

磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。磷光分析法在药物分析，临床分析等领域的应用日益发展。6.2磷光分析法一、概述6.2磷光分析法67二、基本原理(一)磷光的产生和磷光强度

磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。1.磷光的特点：磷光波长比荧光的长(T1<S1)；磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小)；磷光寿命和强度对重原子和氧敏感(自旋轨道耦合，使kISC增加)。二、基本原理(一)磷光的产生和磷光强度682.磷光强度:

IP=2.3PI0bc

式中，

IP：磷光强度，P：磷光效率，

I0：激发光的强度，b：试样池的光程，

：磷光物质的摩尔吸收系数，c：磷光物质的浓度。

在一定的条件下，p、Ip、k、b均为常数，因此上式可写成：

Ip=Kc2.磷光强度:69(二)温度对磷光强度的影响1.随着温度降低，分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强。2.低温磷光(液氮)

由于磷光寿命长，T1的非辐射跃迁(内转换)几率增加，碰撞失活(振动弛豫)的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂：

易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。常用的溶剂：

EPA——乙醇+异戊烷+二乙醚(2+2+5)IEPA——CH3I+EPA(1+10)。(二)温度对磷光强度的影响70(三)重原子效应

使用含有重原子的溶剂(碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称为重原子效应。前者称为外部重原子效应，后者称为内部重原子效应。

机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。(三)重原子效应71(四)室温磷光

低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光(RTP)。1)固体基质：在室温下以固体基质(如纤维素等)吸附磷光体，可增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。2)胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。

利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法的三要素。(四)室温磷光72三、磷光仪器

在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射。转筒式转盘式图6.7磷光分析仪器示意图盛放液氮测定低温磷光在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。三、磷光仪器转筒式转盘式图6.7磷光分析仪器示意图盛放液氮73磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室

试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜

有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下74关于磷光分析仪注意：

在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。1.液槽：将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。2.斩波片：分别测荧光和磷光；测出不同寿命的磷光。关于磷光分析仪注意：75四、应用

磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。

四、应用

磷光分析主要用于测定有机化合物，76（1）相同点：

1.都是电子从激发态跃迁到基态时放出的辐射，波长一般都不同于入射光的波长。

2.温度均低于白灼光，一般在800K以下，故称为化学冷光。荧光与磷光的异同点（1）相同点：荧光与磷光的异同点77

（2）不同点：1.跃迁时重度不同荧光：S1→S0重度未变。

磷光：T1→S0重度改变。2.辐射强度不同荧光：强度较大，因从S0→S1是自旋允许的，处于S1，S2态电子多，因而荧光亦强。

磷光：很弱，因为S0→T1是自旋禁阻的，处于T1态电子少。3.寿命不同荧光：10-9~10-6s，寿命短。

磷光：10-4~10-2s，寿命稍长。（2）不同点：78一、概述

某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。6.2化学发光分析法一、概述6.2化学发光分析法7980

生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。

多种细菌、昆虫、鱼类等均能发光80生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体80化学发光分析具有以下突出特点

灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1ATP

线性范围宽——一般有5~6个数量级

仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究化学发光分析具有以下突出特点灵敏度高——例：81二、化学发光分析的基本原理

化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。（一）化学发光反应的条件

任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤：

化学发光基于化学反应提供足够的能量

A+B→C*+D

产物接受反应能被激发C*→C+hv二、化学发光分析的基本原理化学发光是吸收化学82能够产生化学发光必须满足如下条件：（1）能够快速地释放出足够的能量

在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中。（2）反应途径有利于激发态产物的形成（3）处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其他分子。能够产生化学发光必须满足如下条件：83(二)化学发光效率和发光强度

化学发光反应效率CL，又称化学发光的总量子产率。它等于生成激发态产物分子的化学激发效率r和激发态分子的发射效率f。r

取决于发光所依据的化学反应本身f

与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。激发态分子的化学效率激发态分子的发光效率(二)化学发光效率和发光强度r取决于发光所依据的化学反应84

具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。非生物体的化学发光效率一般不超过1%

化学发光强度ICL(t)与反应速度、化学发光效率有如下关系对下列化学发光反应

A+B→C*+D

C+hICL随时间和反应物消耗的变化逐渐减小。具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发85A+B→C*+D

A：待测物质，C：发光物质

当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应。t时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比。化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总强度来定量分析。发光总强度A+B→C*+DA：待测物质，C：86（三）化学发光反应类型1.液相化学发光——研究和应用较广的有鲁米诺（Luminol）、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05。（三）化学发光反应类型1.液相化学发光87氧化剂425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光，可检测低至10-9mol·L-1的H2O2。氧化剂425nm反应产生的化学能被产物氨基882.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。

在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光，例如：

NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h

（≥600nm）

CO+O→CO2*CO2*→CO2+h

（=300~500nm）

常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng·mL-1测定范围0.01~10000g·mL-1。2.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O89三、化学发光分析的仪器（自学）

化学发光分析法的测量仪器主要包括样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合的方式有不连续取样体系，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。另一种方法是连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。三、化学发光分析的仪器（自学）90(一)分立取样式仪器(一)分立取样式仪器91(二)流动注射式仪器(二)流动注射式仪器92四、化学发光的应用1、可以用化学发光分析测定的物质化学发光分析测定的物质可以分为三类:A、化学发光反应中的反应物;B、化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂C、偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。

这三类物质还可以通过标记方式用来测定人们感兴趣的其他物质，进一步扩大了化学发光分析的应用范围。2、可测定的对象：

无机物、有机物、生物物质等四、化学发光的应用93A、广泛应用于大气中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO等组分的检测。B、鲁米诺—H2O2体系3、目前应用的领域A、广泛应用于大气中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO94荧光与化学发光的异同点（1）相同点：

1.都是电子从激发态跃迁到基态时放出的辐射，波长一般都不同于入射光的波长。

2.温度均低于白灼光，一般在800K以下，故称为化学冷光。（2）不同点：

获得能量的途径不同，荧光是靠吸收紫外-可见光，化学发光是吸收化学能。荧光与化学发光的异同点（1）相同点：

1.都是电子从95本章作业1、2、3、5、7本章作业1、2、3、5、796(MolecularLuminescenceAnalysis)第6章分子发光分析法(MolecularLuminescenceAnalys97第6章红外吸收光谱法6.1荧光分析法6.2磷光分析法6.3化学发光分析法MolecularFluorescenceAnalysisMolecularphosphorescenceAnalysis第6章红外吸收光谱法6.1荧光分析法6.298

分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。

发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能99MolecularFluorescenceAnalysis

一、概述

分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。6.1荧光分法MolecularFluorescenceAnalysi100分子发光光谱

分子发光光谱包括荧光光谱、磷光光谱和化学发光光谱。

荧光和磷光为光致发光，是物质的基态分子吸收一定波长范围的光辐射激发至单重激发态，当其由激发态回到基态时产生的二次辐射。

荧光由单重激发态向基态跃迁产生。

磷光由单重激发态先过渡到三重激发态，然后由三重激发态向基态跃迁向基态跃迁产生。

化学发光是化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射。分子发光光谱101当n,L,S三个量子数确定之后，原子能级就基本确定了。用n、L、S三个量子数描述原子能级的光谱项（n2S+1L）。L与S相互作用，可产生2S+1个能级稍微不同的分裂，是产生光谱多重线的原因。M=2S+1叫做谱线的多重性。习惯上将多重性为1、2、3的光谱项分别称为单重态、双重态、三重态。光谱项与光谱支项当n,L,S三个量子数确定之后，原子能级就基本确定了。光102荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。比UV-Vis的灵敏度高得多。

选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。荧光分析的特点：103紫外可见分光光度法的特点(一)灵敏度高

吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1~10-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-4~10-5%的痕量组分。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。紫外可见分光光度法的特点(一)灵敏度高吸光104二、基本原理

(一)分子荧光的产生

处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。二、基本原理105

根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任意两个能级之间进行，而必须遵循一定的“选择定则”，这个定则是①△L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但当J=0时，△J=0的跃迁是不允许的。不符合光谱选择定则的跃迁叫禁戒跃迁。若两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子具有较长的寿命，原子的这种状态称为亚稳态。光谱选择定则根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任意两个106基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。三重态能级低于单重态(Hund规则)图6.1分子内的光物理过程基态：电子自旋配对，激发单重态：分子吸收能激发三重态：分子吸107

处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。（二）去活化过程(Deactivation)

处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射1081)振动弛豫(VibrationalRelaxation，VR)

在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。1)振动弛豫109荧光、磷光能级图

→振动弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。荧光、磷光能级图1102)内转化(

InternalConversion，IC)

对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。2)内转化111S0S1S2T1吸光1吸光2内转移荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2内转移荧光、磷光能级图1123)荧光发射

处于第一激发单重态(S1)的电子跃迁至基态各振动能级(S0)时，将得到最大波长为3的荧光。

注意：

基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，3的波长较激发波长1或2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。3)荧光发射113荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3荧光荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1144)系间窜跃

指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。

有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。4)系间窜跃115荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3系间窜跃荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1165)外转换(ExternalConversion，EC)

受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。5)外转换117第六章分子发光分析课件118S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸发发系间窜越内转换振动弛豫能l2l1l119（三）荧光效率及其影响因素

荧光量子产率(荧光效率或量子效率)，它表示物质发射荧光的能力，常用下式表示。或=发射荧光量子数/吸收荧光量子数。

在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。（三）荧光效率及其影响因素荧光量子产率(荧120若用数学式来表达这些关系，得到

=kf

/(kf+ki)

式中:

kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和。

凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。

实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明ki很小，可以忽略不计。

一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似。若用数学式来表达这些关系，得到121

分子产生荧光必须具备两个条件：

①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。分子产生荧光必须具备两个条件：122(1)跃迁类型

对于大多数荧光物质：

首先，经历或n激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光(较大)。这是由于跃迁具有较大的(一般比n大100-1000倍)。(1)跃迁类型123其次，跃迁的寿命约为10-7~10-9s，比n跃迁的寿命10-5—10-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小。(S1T1能级差较大)，这也有利于荧光的发射。

总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。其次，跃迁的寿命约为10-7~10-9124(2)共轭效应

容易实现激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭体系化合物除外)。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。

例如：在多烯结构中，Ph(CH=CH)3Ph和Ph(CH=CH)2Ph在苯中的分别为0.68和0.28。

共轭效应使荧光增强的原因：

主要是由于增大荧光物质的

，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。(2)共轭效应125(3)刚性平面结构

多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。(3)刚性平面结构126(4)取代基效应

芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-CO、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。(4)取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代127

卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。

取代基的空间障碍对荧光也有影响。

立体异构现象对荧光强度有显著的影响。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可128四、金属螯合物的荧光

除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。四、金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子129(1)螯合物中配位体的发光

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。

如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。(2)螯合物中金属离子的特征荧光

这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd*跃迁和ff*跃迁，最终发射的是dd*跃迁和ff*跃迁光谱。(1)螯合物中配位体的发1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体例1，2-二苯乙烯反式：平面构型132不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光F=0.92萘VAF133五、影响荧光强度的因素(环境因素）①溶剂对荧光强度的影响

溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。

一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。五、影响荧光强度的因素(环境因素）134

一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。有的情况，增大溶剂的极性，将使n跃迁的能量增大，跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于135

但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。

如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电力状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物136②温度对荧光强度的影响

温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。②温度对荧光强度的影响137③溶液pH值对荧光强度的影响

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。

具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。

对于金属离子与有机试剂形成的发光螯合物，一方面pH会影响合螯物的形成，另一方面还会影响螯合物的组成，从而影响它们的荧光性质。③溶液pH值对荧光强度的影响138④内滤光作用和自吸收现象

溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。

内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。

在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。④内滤光作用和自吸收现象139

⑤顺磁性物质的存在，使激发单重态的体系间窜越速率增大，因而会使荧光效率降低。⑤顺磁性物质的存在，使激发单重态的体系间窜越1402、影响荧光强度的环境因素因素溶剂一般溶剂效应折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同温度温度上升使荧光强度下降内部能量转化作用增大碰撞频率增加，使外转换的几率增加酸度化合物所处状态不同电子构型上有所不同荧光强度和荧光光谱不同2、影响荧光强度的环境因素因素溶剂一般溶剂效应折射率和介六章分子发光分析课件143（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系根据荧光强度的定义式：=If/Ia

荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率(荧光量子效率)。

If=Ia=f（I0-I）Ia：吸收的辐射强度I0：入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A将上式展开（三）荧光强度与荧光物质浓度的关系根据荧光强度的定义式：144

在荧光浓度很稀(A<0.05)时，方括号中除第一项之外的其他项均可忽略，可得：

If=2.3I0A

=2.3I0bc

当入射光强度I0和激发光一定时，上式为：

If=Kc

即，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当A0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。荧光定量分析依据在荧光浓度很稀(A<0.05)时，方括号中145荧光猝灭

荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率f下降称为荧光猝灭。

使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。碰撞猝灭——是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式跃迁，荧光效率降低。

M+激→M*M*+Q→M+Q+热自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。荧光猝灭146

任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧(磷)光定性分析的基础。1)激发光谱

改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到荧光激发光谱。

激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。(四)荧光激发光谱与发射光谱任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与147

激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。

2)发射光谱

发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。

由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。

激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选148图6.2荧光发射光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱图6.2荧光发射光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱149光源氙灯和高压汞灯激发单色器光栅扫描激发光谱，选择激发波长液槽I0

IIf发射单色器扫描发射光谱消除其它光线的干扰，获得所需的荧光检测器显示器光电倍增管三、荧光分析仪器与分光光度计有两点不同

①两个单色器②检测器与激发光互成直角光源氙灯和高压汞灯激发单色器光栅扫描激发光谱，选择激发波长液1501、光源

激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽

荧光计中，常使用卤钨灯作光源

荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1、光源激发光源一般要求比吸收测量中1512、单色器

荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱

大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。

第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex，用此激发光激发液池内的荧光物质ex