59高效液相色谱法讲解

高效液相色谱法

HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY中山高校公共卫生学院肖琴高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）又称高压液相色谱法与经典液相色谱法相比较，HPLC优点：(1)高效——分别效率高(2)高速——流淌相流淌速度快、分析速度快(3)高灵敏度——10-9～10-11g(4)高自动化——自动采集和处理数据，优化选择和限制分别操作条件第一节概述缺点：(1)仪器困难、价格昂贵(2)运用有机溶剂(费用较高，有害健康、污染环境)与GC相比较，HPLC的优点:应用范围广——突出优点不受样品挥发性和热稳定性的影响流淌相可选用不同极性的液体，参与对组分的分配作用，分别效率↑(4)HPLC分别分析后的样品馏分易于收集其次节液相色谱法的分类一、吸附柱色谱法

(adsorptionchromatography)二、支配柱色谱法(partitionchromatography)三、离子交换色谱法(ion-exchangechromatography)四、尺寸排阻色谱法

(sizeexclusionchromatography)

一、吸附柱色谱法

(adsorptionchromatography)吸附柱色谱示意图Tswett色谱分离示意图——又称液固色谱(1)分别原理吸附色谱的实质就是依据组分在吸附剂上吸附实力的不同来进行分别吸附剂通常是多孔的固体颗粒物质，在它的表面存在分散的吸附活性位点

100×300×2000×5000×吸附解吸再解吸再吸附竞争吸附

Xm+nMsXs+nMmXm:在流淌相中的组分分子Xs:在吸附剂表面的组分分子Ms:在吸附剂表面的流淌相分子Mm:在流淌相中的流淌相分子n:组分分子被吸附而从吸附剂表面顶替出来的溶剂分子数吸附柱色谱分别原理吸附剂表面被吸附保留的极性组分分子X吸附剂表面的非极性流淌相分子M固体吸附剂表面吸附活性位点Ka的大小取决于组分分子和吸附剂之间以及组分分子和流淌相之间作用力的强弱Ka值大，表示组分在吸附剂上保留强，难以洗脱Ka值小，表示组分在吸附剂上保留弱，易于洗脱吸附平衡常数Ka(adsorptionequilibriumconstant)

Ka=[Xs][Mm]n[Xm][Ms]n平衡时，通常，吸附等温线分为以下三种：

(1)直线形等温线(2)凸形等温线(3)凹形等温线

吸附等温线确定温度下，组分在固定相中的浓度cS随组分在流淌相中的浓度cm的变更曲线三种吸附等温线和对应的色谱峰形态吸附较坚实导致延迟发生其他反应（如氢键作用）扩散分布中间密，两侧疏对吸附剂的基本要求：不与流淌相和被测组分发生化学反应有高的吸附容量不溶于流淌相等(2)固定相

极性吸附剂

非极性吸附剂

酸性吸附剂碱性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等包括氧化铝和氧化镁等最常见的是活性炭吸附剂的表面结构是确定色谱柱性能的重要因素，同时它的粒度大小、分布范围、装柱技术等对柱效也有很大影响硅胶是最常用的吸附剂，由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸附实力较氧化铝弱

硅胶(SiO2·xH2O)

硅胶结构示意图活性基团硅醇基

水合硅羟基多孔性硅氧烷交联结构

表面(使硅胶失去吸附力)+H2O(能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有吸附性)

Δ,-H2O加热去水过程称为活化含水量大，吸附活性(实力)低，反之吸附活性高氧化铝

酸性氧化铝(pH4~5)

碱性氧化铝(pH9~10)

中性氧化铝(pH~7.5)

——用途最广泛

与硅胶一样，氧化铝也能猛烈地吸水，水不易被其它化合物置换，因而使其活性降低通常也接受加热方法使其活化分别实力强、活性可以限制、应用较广的强极性吸附剂(3)流淌相流淌相又常被称作洗脱剂对流淌相的基本要求：纯度合格对样品有确定的溶解实力，不与样品和吸附剂发生不行逆的化学反应粘度小易流淌性质稳定，有确定的挥发性，对分别组分的回收无干扰作用与检测手段相匹配(4)固定相和流淌相的选择依据被测组分、固定相和流淌相的性质a.被测组分性质（极性大小）烃＜--------＜羧酸，醇b.吸附剂的活性吸附剂的活性越大，对被测组分的吸附实力越强强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂c.流淌相的极性依据“相像相溶”的原理，对极性大的试样接受极性较强的洗脱剂；对极性弱的试样则接受极性弱的洗脱剂流淌相极性越大，对被测组分的洗脱实力越强洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（strengthparameter）0来衡量0越大，表示洗脱剂的极性越强氧化铝上的洗脱序列在硅胶吸附剂中0值的依次与氧化铝相同，数值可按下式换算：可用两种或两种以上的溶剂，按确定比例组成混合溶剂进行洗脱也可在洗脱过程中接受渐渐变更混合溶剂的比例，使其性质渐渐变更，使结构相像的组分得到分别，这种洗脱方式称为梯度洗脱(gradientelution)梯度洗脱可提高分别效率，削减色谱峰拖尾现象d.被测组分、吸附剂和流淌相的关系组分吸附剂流动相极性活性小极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性二、支配柱色谱法(partitionchromatography)(1)分别原理依据试样各组分在两种互不相溶的液体中溶解度不同，即具有不同的支配系数K来实现的(类似于溶剂萃取)——又称液液色谱溶解萃取再萃取再溶解分别原理示意图(反相)被保留的非极性组分分子极性溶剂分子载体（担体）固定液(非极性或弱极性)平衡时，支配系数=[Xs]/[Xm][Xs]:组分X支配在固定相中的浓度[Xm]:组分X支配在流淌相中的浓度(2)固定相固定相是涂渍在惰性载体表面上的固定液

担体(support)担体又称载体，仅起负载固定液作用，是惰性的多孔固体颗粒。要求其有较大的比表面积，且对样品无吸附作用常用的担体有吸水硅胶、硅藻土、纤维素和微孔聚四氟乙烯小球等支配色谱法要求固定液是样品的良好溶剂，不溶或很难溶于流淌相最常用的固定液为：强极性的β,β-氧二丙腈、中等极性的聚乙二醇和非极性的角鲨烷等常用的固体液涂渍方法主要有三种：溶剂蒸发法，沉淀法和动态涂渍早期的固定相为机械涂层固定相——固定液易流失

为了解决固定液流失的问题，改善固定相的功能，常用化学方法把有机分子键合到载体(硅胶)表面，形成化学键合固定相(chemicalbondedstationaryphase)化学键合固定相——以微粒多孔硅胶为载体硅胶结构示意图硅胶官能团有机分子按基团与硅胶相结合的化学键类型分类1.酯化型（Si—O—C）2.硅烷化型（Si—O—Si—C）——应用范围广泛

硅醇基醇酯化反应：硅烷化反应：硅醇基氯硅烷按有机基团的性质分类1.极性键合相(正相键合相)2.非极性键合相(反相键合相)——C18(ODS)柱应用最广泛硅胶表面键合极性有机基团(如氰基、氨基和二醇基)

常用作正相键合相色谱，分析极性较强的化合物硅胶表面键合烃基硅烷常用作反相键合相色谱，分别非极性和极性较弱的化合物化学键合固定相的优点：①传质速度快，柱效高②柱稳定性好，运用寿命长③可键合不同性质的官能团，提高选择性④可利用梯度洗脱，提高分析效率对流淌相的基本要求：与固定液不互溶，极性相差较大；对样品组分的溶解度足够大，但又相对小于固定液对组分的溶解度(3)流淌相分类极性适用范围流出顺序根据流动相和固定相的极性正相分配色谱(常规分配色谱)流动相<固定相极性化合物极性小的先流出反相分配色谱流动相>固定相非极性及弱极性化合物极性大的先流出正相支配色谱和反相支配色谱正相支配色谱(normalphasechromatography)反相支配色谱(reversedphasechromatography)三、离子交换色谱法

(ion-exchangechromatography)以离子交换剂为固定相，利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分别的液相色谱法，主要用于离子型化合物的分别离子交换色谱的柱填料是一种带电荷官能团的固定基质。固体基质上带负电荷的称为阳离子交换剂，带正电荷的称为阴离子交换剂为保持交换剂的电中性，基质上还存在带相同电荷数但正、负号相反的离子，称为反离子（也称可交换离子）(1)离子交换原理

离子交换原理示意图待测组分别子Xm与可交换离子Ym争夺离子交换剂上带电荷的交换基团Rs，进行离子交换溶剂分子待测组分X（离子型化合物）离子交换剂带电荷的活性基团R可交换离子YXm+RsYYm+RsXKXY=[RsX][Ym][RsY

][Xm]其交换反应如下：反应达平衡时，平衡常数为：平衡常数KXY又称为离子交换反应的选择性系数(2)固定相分类按可交换的活性基团不同分类

分类活性基团强酸性阳离子交换剂－SO3H弱酸性阳离子交换剂－COOH或－PO3H-强碱性阴离子交换剂－N+R3X-弱碱性阴离子交换剂－NH2,－NHR或－NR2按基体不同分类

按物理结构不同分类

按活性基团接入基体的制备方式不同分类

合成树脂(聚苯乙烯)型、纤维素型和硅胶型微孔型(或凝胶型)、大孔型、薄壳型或薄膜型等物理涂渍型和化学键合型离子交换剂的不同物理结构(a)微孔型;(b)大孔型;(c)薄膜型;(d)表面多孔型离子交换树脂的主要性能指标

交联度(degreeofcrosslinking)

聚苯乙烯型合成树脂交联剂：二乙烯苯（交联形成网状结构）直链中的聚乙烯链节结构交联度孔洞交换速率选择性适用范围大小慢好分子量较小的离子性物质小大快差分子量较大的离子性物质交联剂是指能在线型结构分子缩聚时起架桥作用而使其分子中的基团相互键合成为不溶网状体的物质树脂中交联剂的含量叫交联度，以重量百分比表示，范围从1%到16%交换容量(exchangecapacity)

粒度

每克干树脂能参与交换反应的活性基团数单位：mmol/g或mmol/ml反映了树脂进行交换反应实力的大小离子交换树脂颗粒的大小用树脂溶胀态所能通过的筛孔目数表示制备纯水多用10~50目，色谱分析一般为100~200目

一般来说，离子强度的变更要大于pH值变更对保留值的影响(3)流淌相离子交换色谱的流淌相大多为水溶液增加离子强度，减弱试样离子的竞争交换实力，使试样离子保留值降低流淌相pH值的变更，能导致可解离化合物的电离度发生变更，如电离度增大，则试样的保留值也增大在流淌相中添加有机溶剂（如甲醇或乙醇），可使峰的拖尾得到改善，并能调整组分的保留值分别原理示意图不具有吸附、支配和离子交换作用机理，而是基于分子的尺寸和形态不同来实现分别(1)分别原理——又称凝胶色谱或空间排阻色谱不同尺寸、形态的组分分子惰性多孔结构的凝胶四、尺寸排阻色谱法

(sizeexclusionchromatography)凝胶色谱法示意图一般来说，凝胶色谱适用分别分子量从几千到几百万的试样，且分子量差别需在10%以上时才能得到分别按相对分子质量降低的次序被洗脱

(2)固定相按机械强度不同软质、半硬质及硬质凝胶按化学成分不同有机和无机凝胶按制备方法和孔穴结构差异匀整、半匀整和非匀整凝胶按对溶剂的运用范围不同亲水性、亲油性和两性凝胶分类：应用最多的是多孔性凝胶依据机械强度的不同一般可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类软质凝胶(如葡聚糖等)在压强0.1MPa左右即被压坏，不适宜用在HPLC中对流淌相的基本要求：能溶解试样，并且与固定相凝胶性质相像，能浸润凝胶溶剂的黏度要低与接受的检测器相匹配常用的流淌相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等凝胶过滤色谱水溶液水溶性样品凝胶渗透色谱有机溶剂非水溶性样品流淌相样品(3)流淌相依据性能和用途不同可分为三类：

(1)分析型(2)制备型(3)专用型主要由四部分组成：(1)高压输液系统(2)进样系统(3)分别系统(4)检测系统(5)数据记录与处理系统其他帮助装置：(1)梯度洗脱装置(2)自动进样(3)数据处理系统第三节高效液相色谱仪高效液相色谱仪LC-10AvpPlus高效液相色谱仪LC-2010HTAgilent1100系列高效液相色谱系统

高效液相色谱仪的工作流程

高压输液系统一、高压输液系统高压输液系统一般组成：(1)贮液器(2)高压输液泵(highpressurepump)——供应动力(3)过滤器(4)压力脉动阻尼器核心部件流淌相的作用：(1)携带样品通过色谱柱(2)供应支配相，调整选择性，实现分别用作HPLC流淌相的溶剂：有机溶剂、水、无机盐的水溶液等流淌相分为单一流淌相和混合流淌相对流淌相的基本要求：1.对被分别样品有适宜的溶解度(K为1～10)2.与样品及固定相不发生不行逆化学反应3.粘度小，纯度高4.与检测器匹配流淌相的处理：1.

纯化

2.脱气水：高纯水有机溶剂：色谱纯脱气方法：减压脱气(2)煮沸脱气(3)超声波震荡脱气（不会造成组成的变更）高压输液泵应符合要求：

(1)密封性好，耐腐蚀

(2)有足够的输出压力——30~50Mpa(3)输出压力平稳，脉冲小

(4)输出流量恒定，可调范围宽，流量精度1%~2%(5)泵室体积小(＜0.5ml)常用的高压输液泵分为以下两种：(1)恒流泵——输出流量恒定

(2)恒压泵——输出压力恒定缺点：保留时间重现性差，更换溶剂或清洗较麻烦柱塞往复泵恒流泵螺旋注射泵二、进样系统常用的进样方式有两种：(1)注射器进样(2)六通阀进样——普遍接受六通阀进样优点：(1)进样时可保持系统高压(2)进样方式简便、易操作(3)进样精确、重现性好(4)自动化程度高(5)适于作定量分析六通阀进样示意图a.进样位置(样品进入定量管)b.进柱位置(样品导入色谱柱)1.定量管2.样品进入口3.流淌相进口4.色谱柱三、分别系统分析柱前加一个短的疼惜柱——保持色谱柱的性能包括色谱柱、恒温器及连接管等

色谱柱——HPLC心脏部件由色谱柱管和固定相组成

——柱温显著影响组分的保留值恒温器分析型制备型柱长10～30cm，内径2～6mm，直型柱长25～50cm，内径40～120mm注：HPLC分析通常在室温下进行四、检测系统按其应用范围分为通用型和专用型（选择性）1.紫外检测器（ultraviolet-visibledetector,UVD或UV）2.荧光检测器（fluorescencedetector,FD）3.电化学检测器（electrochemicaldetector,ED）5.示差折光检测器（differentialreflactiveindexdetector,DRID）4.蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatterdetector，ELSD）1.紫外检测器（ultraviolet-visibledetector,UVD或UV）——应用最广泛的通用型检测器

工作原理和结构与一般紫外分光光度计相同被分析组分对特定波长的紫外光或可见光有选择性吸取，待测组分浓度与吸光度的关系听从Lambert-Beer定律不同之处：将样品池改为体积很小（5～12ml）的流通池流通池示意图1.流淌相出口2.流淌相入口3.透镜32211Z型H型光路紫外检测器的特点：(1)灵敏度高，最小检测浓度为10-10g/ml(2)线性范围宽，对温度和流淌相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱(3)应用范围广泛紫外检测器的种类固定波长型可调波长型二极管阵列检测器光源检测波长特点低压汞灯氘灯固定254nm或280nm190～800nm连续可调结构简洁，但灵敏度和应用范围受限应用广泛三维色谱-光谱图，给出光谱定性信息190～700nm快速扫描氘灯与UVD的主要区分：进入流通池的光是整个紫外-可见光谱区的复合光，当复合光被组分选择性吸取后，其透过光具有了组分的光谱特征，此透过光被光栅分光后，照射到光电二极管阵列上二极管阵列检测器——以光电二极管阵列作为检测元件优点：(1)可同时采集不同波长下的色谱图，以计算不同波长的相对吸取比(2)可供应UV-Vis谱，选择最佳检测波长(3)检查色谱峰各个位置的光谱，可以评价物质的纯度(4)可利用色谱保留值规律及吸取光谱综合进行定性分析二极管阵列检测器光路图三维色谱-光谱图时间波长吸光度2.荧光检测器（fluorescencedetectorFD）

原理及仪器结构与荧光分析法相同荧光检测器的特点：(1)灵敏度更高，比紫外检测器高3～4个数量级，检测限可达10-12～10-14g/ml(2)对温度和流淌相流速的变更不敏感(3)可进行梯度洗脱具有荧光特性的样品受紫外光激发后放射荧光，在确定条件下其荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系——选择性检测器3.电化学检测器（electrochemicaldetectorED）对流淌相的要求：必需含有电解质（离解常数高，在电极表面呈现惰性）常用的是安培检测器检测原理：测量电流与氧化还原物质的浓度成正比——选择性检测器

电化学检测器种类较多，有电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器

缺点：(1)需运用缓冲液作流淌相(2)电极寿命较短(3)不宜运用梯度洗脱优点：(1)灵敏度高，检测限可达10-12g/ml(2)选择性好（具有氧化还原活性的物质）(3)线性范围宽(4)设备简洁、成本低、操作便利4.示差折光检测器（differentialreflactiveindexdetector,DRID）优点：操作简便缺点：(1)灵敏度不高(2)对温度变更敏感(3)不能用于梯度洗脱检测原理：——通用型检测器利用纯流淌相和含有被测组分的流淌相之间折光率的差别进行检测HPLC常用检测器主要性能五、帮助装置其他帮助装置：(1