怎样用好液相色谱北极熊校园

怎样用好高效液相色谱reserviorinjectorpumpcolumndetectorDatasystem液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接常见的液相色谱仪问题色谱峰加宽分辨率低裂峰柱压比预期值高液相色谱仪的使用正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下：

相对比较便宜不需要花费大量的时间系统中大多数流体连接均易于检修通常有助于避免不必要的硬件替换接头对正确连接至关重要，因此知道接头的一些基本特点也很重要。液相色谱仪的正确连接液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接接头的普通特征

螺纹（10-32，¼-28，M6x1）管道外径（1/16”、1/32”、1/8”）端口几何形状（锥形、平底）管套直径

接头要素液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接通用端口有以下特征：螺纹管道尺寸内部几何形状…但并非所有的接头都是通用的!接头要素液相色谱仪的使用接头要素液相色谱仪的正确连接连接出现泄漏后将会引发以下问题：系统压力损失注射假象（鬼峰）出现混合室（死体积）将会引发以下问题：色谱峰加宽分辨率减低显著残留裂峰引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生!液相色谱仪的使用接头要素液相色谱仪的正确连接选择匹配的接头时，应首先清楚以下问题：使用的端口螺纹类型（例如，10-32、¼-28等。）使用的端口几何尺寸（例如，锥形或平底）所需连接的管道外径（例如，1/16”，1/8”）是否可以手动紧固连接接头应与哪些化学药品兼容接头应该承受多大压力液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑：管道的正确型号管道的最有效尺寸切割管道的合适工具如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题：接受端口需要什么尺寸的管道？流速多少？管道将会产生多大压力？接头提供的管道尺寸是多少？请始终注意……

-高压管道最常见的尺寸为：1/16”ODx.010”ID-低压管道最常见的尺寸为：1/8”ODx1/16”ID液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接储液器和泵之间的管道连接管道通常用Teflon®材料制造，尺寸为1/8”ODx1/16”ID。将管道连接至泵上的接头通常为¼-28螺纹，平底几何形状。泵和检测器之间的管道连接管道通常用PEEK™聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为：1/16”ODx.010”ID或稍小。将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32螺纹，锥形几何形状。检测器之后的管道连接管道通常用Teflon®材料制造，尺寸为1/16”OD选择正确接头和管道的一般准则液相色谱柱的结构：空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。色谱柱的安装：

a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。色谱柱的安装：

c、按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。液相色谱柱的安装液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的关键所在。流动相脱气吹氦脱气法加热回流法抽真空脱气法超声波脱气法在线真空脱气法液相色谱仪的使用设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞

色谱柱，尤其是使用无机盐配制

的缓冲液。必须做!溶剂和水的前处理：过滤液相色谱仪的使用设备和材料：超声波清洗机脱气的目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：

1）柱流量不准

2）检测器基线波动脱气注意点：

1）每天脱气(无在线脱气器时）

2）混合溶剂脱气时间不能过长必须做!溶剂和水的前处理：脱气流动相过滤头产生的问题故障特征 “鬼峰”(由已被污染的过滤头造成) 保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞)溶剂过滤头的清洗1.取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟;2.取出后用蒸馏水超声清洗10分钟;3.用吸球吹出过滤头中的液体;4.再用蒸馏水超声清洗10分钟;5.用吸球吹净过滤头中的水份;6.将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将过滤头烘干)溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯溶剂等级微量分析、梯度洗脱都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质溶剂纯度的影响

溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度洗脱时注意： 只能使用色谱级的溶剂!

不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差，进行样品之前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰。梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡。梯度洗脱溶剂混合产生的问题流动相中所使用的不同溶剂必须互溶流动相中溶剂不互溶会导致:1.基线漂移，2.保留时间的重现性差，3.出现肩峰和“鬼峰”的问题.流路中形成气泡引起的问题

改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声液相色谱分析实验室常备的流动相和固定相

为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相（1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷，这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。（2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。几点注意事项

色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。液相色谱仪的使用流动相及储液器1.尽量使用HPLC级的溶剂与试剂.2.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相3.改变流动相时防止交叉污染.4.不要使用陈旧的流动相.5.定期清洗流动相储液瓶.6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.液相色谱仪的使用对流动相的要求

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：

（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。

（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。液相色谱仪的使用对流动相的要求

（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.液相色谱仪的使用常用流动相的紫外截止波长溶剂正己烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氢呋喃丙酮乙腈甲醇水紫外截止波长nm190380265210245233212330190205187液相色谱仪的使用常用流动相的强度参数溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0氟烷－0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82环己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.951.

使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀

2.

进样前最好使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样品处理1-低压计量泵;1A,1B-时间比例电磁阀;2-微处理机;3-混合器;4-高压输液泵;5-至色谱柱6-反馈控制器;7-混合室;8-流量计信号;9-混合溶剂出口高压梯度低压梯度1-程序控制器;2-溶剂A;3-溶剂B;4-高压泵A;5-高压泵B;恒流泵中气泡的排除打开放空阀，按仪器前面板的“冲洗”功能键，用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续，证明气泡已经排除；如果用”冲洗”状态仍不能吸液，可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸，直至液体流出；如果仍然无液体流出，可能是阀球阀座粘连，取出单向阀，向单向阀两端分别吹气，一通一堵为正常，两端均堵说明阀球座粘连，需清洗阀球阀座。液相色谱仪的使用高压输液泵1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。2.使用HPLC级的流动相试剂.3.使用不锈钢烧结吸液滤头.4.用纯水或双蒸蒸馏水，流量3～5ml/分，冲洗15分钟，冲洗时必须打开排放阀（逆时针拧松）必须做!使用输液泵的注意事项液相色谱仪的使用操作极限预防1.严禁在无流动相时启动高压输液泵.2.设定泵的上限压力(≤25Mpa)防止长期压力过高损坏泵和进样阀.3.设定泵的下限压力(0.5～1Mpa)防止流动相抽干和严重泄漏.输液泵发生故障及相应排除措施故障

可能原因

解决办法无流动相流出，又无压力指示泵内有大量气体打开泄压阀，以较大流量（5mL/min)运转，密封圈损坏更换压力和流量不稳有气泡打开泄压阀，以较大流量（5mL/min)运转，单向阀内有异物稀硝酸超声清洗压力高堵压力低漏液相色谱仪的使用自动进样器手动进样器原理：六通阀注入方式：

1）全量注入

2）部分注入进样器样品装填状态

(LOAD)手动进样器原理图注射状态(INJECT)液相色谱仪的使用高压进样阀必须做!每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐.防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子.冲洗方法见进样阀说明书.严禁用!严禁使用气相色谱那样的尖头针进样.根据情况定在注射针前加装针式过滤器,防止样品中的微粒进入进样阀.手动进样法一般的方法

1.在进样状态下清洗针口

2.在装填状态下插入微量注射器

3.注入样品

4.切到进样状态便捷的方法（不需清洗）

1.进样状态下插入微量注射器

2.切到装填状态

3.注入样品

4.切回到进样状态高效液相色谱检测器紫外检测器折光指数检测器电导检测器荧光检测器蒸发激光检测器检测器的保养紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时，打开检测器；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）样品池要保养1）用HPLC级溶剂2）过滤流动相和溶剂3）脱气4）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中液相色谱仪的使用紫外检测器每次做1.流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗.2.使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内.经常做3.不定期的用强溶剂反向冲洗流动池(拆开柱子).4.不定期的使用空流动池校正波长.根据情况定5.在流动池出口加装背压阀.液相色谱仪使用中的问题预柱与保护柱从泵来的流动相预柱进样器保护柱分析柱到检测器预柱对流动相而言保护柱对色谱柱而言液相色谱仪使用中的问题良好的柱使用规范在使用前过滤溶剂完全润湿在运输中变干的色谱柱了解溶剂对样品的溶解性及对分离的影响对含有保留性较强的杂质组份的样品进行预处理注意柱子的pH使用范围定期用强极性的溶剂清洗色谱柱储存色谱柱时要冲尽缓冲液,并用有机溶剂饱和柱子避免外力损伤色谱柱,如弯曲、跌落等液相色谱仪使用中的问题使用保护柱带整体过滤片的Techtron保护柱液相色谱仪的使用液相色谱柱1.流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强.2.避免样品微粒在柱头沉积.3.防止过高压力冲击色谱柱.4.流动相pH大于7时要使用保护柱.5.正确制备样品,在样品注射器前加装针式过滤器.6.色谱柱不用卸下前:a.必须洗去缓冲液.b.防止产生微生物

c.用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱.d.柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封.液相色谱仪的使用分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：使用柱温箱液相色谱仪的使用整台液相色谱仪的维护1.在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。2.关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系统，时间为15～20分钟，流量1ml/分。本步骤主要是冲洗干净系统内其他含盐的部位。3.用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。本步骤主要是保护色谱柱。4.如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。每次用过仪器后必须做!HPLC的日常操作条件最好是恒温、恒湿温度：15—30℃相对湿度<80%房间应有良好的通风空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器避免光线直射远离高电干扰、高振动设备液相色谱分析

分析型液相色谱定性及定量分析

a.灵敏度的要求

b.样品的复杂性

c.样品量的要求

d.精度及准确度的要求

e.容易使用液相色谱分析

制备型液相色谱分离及纯化

a.化合物的稳定性

b.样品的复杂性

c.制备量的要求

d.纯度的要求及纯度的鉴定

e.方法的安全性液相色谱分析Q：需要什么样的分离结果？A：分辨率高。液相色谱分析什么是色谱的分辨率？分辨率R的公式：液相色谱分析影响分辨率的因素：k’，α，N分辨率的方程：k’是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。α是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度，是化学因素。N是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。液相色谱分析色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：液相色谱分析提高柱效的方法色谱柱本身减小填料的颗粒度找到最佳的流速（根据不同的内径）合适的温度降低溶剂的粘度增加柱长液相色谱分析其他影响柱效的因素柱外效应连接管路进样器检测器进样体积样品浓度液相色谱分析容量因子K’与峰高的关系与R的关系改变K’值的方法：调节流动相的极性、pH、离子强度等梯度淋洗k’=(tR-t0)/t0液相色谱分析选择性系数α定义：α＝1时两组分分不开，改变α的途径：改变流动相改变固定相改变温度改变样品的本身性质液相色谱分析α、K’、N如何控制分辨率

原始分离状态改变K’

后改变

α后改变N后液相色谱分析

分析方法建立的实例等度分析色谱柱：C18，4mm×30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)液相色谱分析

分析方法建立的实例改变容量因子

K'液相色谱分析

分析方法建立的实例改变选择性∶a通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱123THF/H2O28:72MeOH/H2O58:42CH3CN/H2O38:62液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法的建立梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低分析时间长液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A泵溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度洗脱的可变参数A及B(可能还有C和D液)的成分和化学特性梯度的陡度梯度的变化形状液相色谱分析液相色谱的检测模式项目示差折光电导紫外荧光电化学响应通用选择性选择性选择性选择性灵敏度毫克纳克纳克皮克皮克线性范围104106105105106流速敏感是是否否是温度敏感是是否否是梯度淋洗不可有限制可以可以脉冲可以灵敏度、选择性、适应能力液相色谱分析开发液相色谱分析方法分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考虑。

1.灵敏度5.成本

2.载样量6.容易使用

3.分析速度7.色谱柱寿命

4.溶剂消耗8.效率液相色谱分析液相色谱分析方法的建立1建立液相色谱分析方法通常有以下几步：（1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用（2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）；（3）选择合适的色谱柱；（4）溶解度－选择流动相的条件（5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？（6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理液相色谱分析液相色谱分析方法的建立2续前一页（7）选择合适的K’值的条件；（8）选择良好的峰位（α值）；（9）选择良好的色谱柱条件（N值）；（10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？（11）用实测样品解决出现的特殊问题；（12）证实方法的正确性。方法样品特点/色谱柱何时应用该方法反相HPLC流动相：水/有机溶剂色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。离子对HPLC流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂）色谱柱：C18（ODS），C8，氰基离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC硅胶最好液相色谱分析选择液相色谱的方法主要液相色谱方法特性方法描述/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法流动相：水相，另以缓冲物控制pH色谱柱：阳离子或阴离子交换分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择体积排阻色谱法流动相：水相（GFC）或有机相（GPC）色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布疏水作用色谱法流动相：盐溶液色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多用于分离蛋白质液相色谱分析选择液相色谱的方法次要液相色谱方法特

性液相色谱分析液相色谱的保留保留时间tR的初步估计：保留时间tR

＝死时间t0(1+峰容量因子k’）峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0t0≈0.5Ld2左式中：

t0－进样峰的出峰时间tR=t0(1+k’)tR－峰的保留时间

L－柱长(cm)k’=(tR-t0)/t0d－柱内径(cm)

k’－峰的容量因子

液相色谱分析反相色谱不同配比流动相与容量因子值甲醇/水乙腈/水四氢呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01液相色谱分析溶剂强度

改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增加甲醇的比例，流动相变强。液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇。

在反相色谱中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要减少2-3倍。液相色谱分析峰位的重排在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排：（1）流动相中换了强溶剂种类；（2）pH值的改变；（3）柱填料的改变；（4）柱温的改变；（5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）噪音高或基线漂移解决问题可能原因柱子没有平衡好杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质在柱子中的富集检测器或色谱柱的温度差异系统有气泡检测器氘灯需更换电压不稳造成干扰解决办法继续冲洗色谱柱至平衡利用强极性的溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱；提高样品的预处理；使用色谱纯的溶剂使用色谱柱恒温箱流动相脱气；更换氘灯使用稳压电源；检查供电系统出现“鬼峰”解决问题可能原因上一针样品中没有完全流出的物质色谱柱被污染溶剂中有杂质流动相和溶解样品的溶剂不互溶解决办法待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改进样品的预处理每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲色谱柱；改进样品的预处理使用色谱纯的溶剂尽量用流动相溶解样品；出现肩峰或前延峰解决问题可能原因柱头“塌陷”造成死体积溶解样品的溶剂选择错误干扰物质的存在；样品中的杂质色谱柱过载柱外效应的影响解决办法更换色谱柱用流动相溶解样品改进样品预处理；使用色谱纯溶剂将样品稀释检查管路连接峰形展宽解决问题解决办法更换色谱柱或预柱减少进样体积；稀释样品用流动相溶解样品检查管路连接检查是否有漏；使用小的检测池提高色谱柱温度更换色谱柱可能原因色谱柱或预柱被污染或不合适色谱柱“过载”或进样体积过大溶解样品的溶剂选用不当柱外效应的影响色谱柱和检测器之间有漏；检测器的检测池过大色谱柱温度太低；流动相的黏度太高色谱柱柱效下降出现脱尾峰解决问题解决办法减少样品体积；改进样品预处理；调节流动相的组成；使用流动相改性剂（如三乙胺）；降低流动相的pH值；使用碱性去活的色谱柱更换滤网；使用柱前过滤系统；将样品过滤检查管路连接更换色谱柱；可能原因色谱柱过载干扰峰；杂质硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响色谱柱的滤网堵塞柱外效应的影响；死体积色谱柱有“塌陷”、短流或断流出现双重峰或分叉峰解决问题可能原因样品体积过大；色谱柱过载溶解样品的溶剂选用不当色谱柱有“塌陷”、短流或断流色谱柱滤网堵塞进样器没有彻底清洗解决办法减少进样体积；稀释样品；将样品在流动相中溶解更换色谱柱；使用较温和的分离条件更换色谱柱的滤网；使用柱前过滤装置；过滤样品彻底清洗进样器；更换进样器转子保留时间变长解决问题可能原因流速降低硅胶表面有活性点键合相流失流动相的组成有变化温度降低解决办法检查系统是否有漏；更换泵的密封圈；排净气泡；使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；使用碱性去活的色谱柱保持流动相pH值在2-7.5范围内检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱保留时间缩短解决问题可能原因流速升高色谱柱过载键合相流失流动相组成发生变化温度升