日本岛津UV分光光度计操作培训

山东安和安全技术研究院有限公司检测部Tel:(0543)3065070E_mail:bzsah20110801@163.com岛津UV2550紫外/可见分光光度计操作培训?2?紫外-可见吸收光谱?吸收光谱的测量-----Lambert-Beer定律?紫外-可见分光光度计仪器组成?分析条件选择?UV-Vis分光光度法的应用?紫外-可见分光光度计的维护和保养?UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。?UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160~780nm.?UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。目录3ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可见吸收光谱4ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited4电磁波谱g-X-射线紫外可见红外微波无线电2004008003200(nm)波长真空紫外近红外核磁共振波长越短，能量越高5ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited5一、分子吸收光谱的形成1.过程：运动的分子外层电子--------吸收外来外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱。??h*MhMt0II???????基态E0激发态E1DE=E1-E0=h?能量激发e能量差DE6ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited62.能级组成：除了电子能级(Electronenergylevel)外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动(Vibration)能级和转动(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化DE为各种形式能量变化的总和：其中DEe最大：1-10eV;DEv次之：0.05-1eV;DEr最小：?0.05eVrveΔΕΔΕΔΕΔΕ???7ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited7能级跃迁示意图?电磁波与分子相互作用时产生能级跃迁：能级振动能级跃迁转动能级跃迁v1v2v0543210电子能级跃迁E1E0v0v1v2E=h?其中h为普朗克常数(6.626×10-34焦耳·秒）?为频率8ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited8各轨道能级高低顺序：????n??*??*；可能的跃迁类型：?-?*；?-?*；?-?*；n-?*；?-?*；n-?*9ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited9?-?*：C-H共价键，如CH4（115nm）；C-C键，如C1H6(135nm)，处于真空紫外区；?-?*:和?-?*跃迁：尽管所需能量比上述?-?*跃迁能量小，但波长仍处于真空紫外区；n-?*：含有孤对电子的分子，如H1O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);CH3I(158nm)；(CH3)1S(119nm)；(CH3)1O(184nm)CH3NH1(115nm)；(CH3)3N(117nm)，可见，大多数波长仍小于200nm，处于近紫外区。以上四种跃迁都与?成键和反键轨道有关（?-?*，?-?*，?-?*和n-?*），跃迁能量较高，这些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。只有?-?*和n-?*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。10ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited10几个概念：生色团（Chromogenesisgroup）：分子中含有非键或?键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起n-?*和?-?*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。助色团（Auxochromousgroup）：含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。红移或蓝移（Redshiftorblueshift）：在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向（红移）或短波方向移动（蓝移）的现象。11ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited吸收光谱的测量Lambert-Beer定律12ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited12一、透射率T%入射光I0透射光I光程长b透射率T%=II0×100%13ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited13当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。?当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即?当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以?表示，即?比a更常用。?越大，表示方法的灵敏度越高。?与波长有关，因此，?常以??表示。kbcA?abcA?bcA??14ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited14样品吸光度A与光程b总是成正比。但当b一定时，A与c并不总是成正比，即偏离L-B定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。1.样品性质影响a）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收能力发生变化---?变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。三、偏离L-B定律的因素15ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited152.仪器因素仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。a）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。b）谱带宽度与狭缝宽度：“单色光”仅是理想情况，经分光元件色散所得的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带宽度)。单色光的“纯度”与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。16ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可见分光光度计仪器组成17ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited17UV示意图18ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited18紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。一、光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。1.钨及碘钨灯：340~1500nm，多用在可见光区；2.氢灯和氘灯：160~375nm，多用在紫外区。二、单色器(Monochromator)与原子吸收光度仪不同，在UV-Vis光度计中，单色器通常置于吸收池的前面！（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解）三、吸收池(Cell，Container)：用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。四、检测器：硅光电池、PMT、PDA19ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited19UV2550光路图20ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited20分光光度计的校正当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对其进行校正。波长标度校正：使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度标度校正：采用K2CrO4标准液校正（在15oC时，于不同波长处测定0.04000g/L的KOH溶液（0.05mol/L）的吸光度A，调整光度计使其A达到指定的吸光度。21ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分析条件选择22ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited22一、仪器测量条件由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。由L-B定律：微分后得：将上两式相比，并将dT和dc分别换为DT和Dc，得当相对误差Dc/c最小时，求得T=0.368或A=0.434。即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。bcTA????lgbdcTdTTd????434.0lgTTTcclg434.0D?D23ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited23二、反应条件选择1.显色剂的选择原则：使配合物吸收系数?最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2.显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。3.溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。4.显色时间、温度、放置时间等。24ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited24三、参比液选择1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；2.试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；3.试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。25ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited25四、干扰消除1.控制酸度：配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物，而与Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。2.选择掩蔽剂3.合适测量波长4.干扰物分离5.导数光谱及双波长技术26ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可见分光光度法的应用27ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited27一、定性分析不同物质结构不同或者说其分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。定性分析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。28ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited28?-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种化合物的分子吸收光谱图29ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited29二、定量分析1.单组份定量方法1）标准曲线法(职业卫生检测中常用)：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的条件下，测量吸光度，用吸光度对样品浓度绘制标准曲线标准曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的条件测量吸光度，然后根据吸光度在标准曲线上直接读出样品组分的浓度。2）标准对比法：该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。30ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited30二、定量分析步骤（标准曲线法）1.先开主机，然后再打开UVPROBE软件；2.启动UVPROBE以后，点击界面下方“连接”进行仪器连接，仪器进行连接检查，待检查全部通过后，点击“OK”3.点击“光度测定”；4.点击“方法”，波长设定为通过光谱检测到所测样品的最大吸收波长,然后加入波长，类型多选择为“多点”，WL1=最大波长。点击“下一步”，（注：根据所测样品对相应的参数进行设定），“方法”设定完后，点击“关闭”；5.将两个空白参比放入光束吸收池架；6.点击“自动调零”；7.双击标准表中的任意位置激活标准表，在表头位置将显示激活；31ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited318.点击下拉菜单中的I-扣空白；9.在标准表中依次输入标准系列ID；10.读取标准样品：将两个空白参比放入光束吸收池架，点击“自动调零”，然后放入样品，输入样品浓度，依次进行“读取”。样品的浓度读取完后，在“标准曲线”表中点击“右键”-“属性”中选择“方程式”、“相关系数”，查看标准曲线；11.样品读取：点击样品表中的任意位置激活标准表，在表头位置将显示激活；12.在样品表中输入样品ID，放入待测样品，进行“读取”。13.打印结果：点击文件-打印-（选择打印标准表或样品表）14.关机：点击操作界面“断开”，然后关闭仪器电源，关闭操作软件，关闭电脑，将比色皿倒扣放置保存。32ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可见分光光度计的维护与保养33ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited33一、环境要求１、使用工作温度：15～35℃，湿度：45～80%，如果温度高于30℃，则湿度必须小于70%２、避免日光直射３、避免震动４、避免强磁场，电场５、远离腐蚀性气体，并避免置于任何可能导致紫外区吸收的含有机/无机试剂气体的区域６、避免脏污、多尘环境34ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited34二、工作台要求１、可承受压力35Kg+25Kg（PC）２、最小尺寸：长：1