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文档简介

实验七重组克隆子的酶切鉴定背景理论知识Section17.1.1实验目的了解转化子鉴定原理，掌握各方法适用的情况质粒快速抽提试剂盒、酶切鉴定上次实验的转化子重组子鉴定可从以下水平进行：DNA水平：快速抽提酶切分析原位杂交

Southern杂交

DNA顺序分析

PCR检测mRNA水平：RNA杂交反转录-PCR蛋白质水平：免疫沉淀检测法功能水平：抗性反应显色反应酶切和电泳方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法

DNA杂交直接鉴定纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析转化子的分析——Southern杂交本次实验方法试剂盒快速抽提质粒DNA、酶切鉴定转化子实验操作Section21、挑选阳性克隆子培养(已做)2、抽提质粒3、酶切分析4、电泳鉴定7.2.1【实验步骤】1.5-5ml过夜培养菌液,倒入EP管中(标记),10000rpm离心1min,弃上清。（已做）

加入250µl溶液I（含RNaseA），充分混匀。加入250µl溶液II，轻轻混匀，室温放置2min。加入350µl溶液III，轻轻混匀，13000g离心10min。将上清液转移至纯化柱中（标记），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。2、抽提质粒(每人提取2个样品:1个PCR证明有插入片段的菌,另1个菌由杨老师提供)在纯化柱中加700µlDNA漂洗液（含70%乙醇），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。重复步骤6。再次13000g离心2min,用于干燥纯化柱。丢掉下层收集管，将纯化柱放入新的1.5mlEP管（标记）。小心加入30ul50-60度预热的ElutionBuffer（Tbufferor纯H2O）（要加到柱子正中间，是液体均匀扩散到DNA吸附填料上），室温放置2min，13000g离心1min，下层新EP管中液体为所纯化的质粒DNA。3、酶切分析(每人做2个样品)

无菌ddH2Oupto10µl10xbuffer1µl

质粒DNA5µl

BamHI

1µl

NotI

1µl

总体积10µl

混匀后,离心(Short),37℃酶切50分钟4、电泳鉴定配胶:1%琼脂糖凝胶25ml(2人配一块胶,使用11个小齿的梳子)制样和点样:4样品/人,2个酶切产物（10ul+2ul上样2），两个对应质粒（5ul+1ul6x上样缓冲液）电泳:110V电泳30min,停止电泳并照相。注意:1.务必记录点样顺序和点样量

2.本次提取的质粒是下次实验材料负极－正极＋Marker酶切1质粒1酶切2质粒2质粒2酶切2质粒1酶切1A1A25µl+1.5µl6上样缓冲液5µl2µl+2.5µl6上样缓冲液避免DNA酶污染

避免过多蛋白污染

注意事项

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