第五章固定化酶

第五章固定化酶1第1页，共95页。Contentsofchapter5五、固定化酶的应用四、固定化酶反应器三、固定化酶的性质二、固定化酶制备一、固定化酶发展简史GoGoGoGoGo2第2页，共95页。问题：酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。办法：将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。

固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。一、固定化酶发展简史3第3页，共95页。4第4页，共95页。

1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。

1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。

1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。5第5页，共95页。二、固定化酶的制备(一)吸附法（二）包埋法（三）共价结合（偶联）法（四）交联法（五）四种固定化酶制备方法的特点小结（六）固定化方法与载体的选择6第6页，共95页。Methodsofimmobilization7第7页，共95页。(一)吸附法

吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。8第8页，共95页。根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附法(physicaladsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。

常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。9第9页，共95页。离子结合法(ionbinding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。

最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。10第10页，共95页。

1.影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。11第11页，共95页。优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。

世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。2.吸附法的优点、缺点12第12页，共95页。（二）包埋法

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法成为包埋法。13第13页，共95页。1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：

将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。

聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：

先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。

它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。

14第14页，共95页。海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。

K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。

胶原和明胶也是常用的包埋载体。15第15页，共95页。2、微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。

16第16页，共95页。17第17页，共95页。优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。

缺点：是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。3.包埋法的优点、缺点18第18页，共95页。

（三）共价结合（偶联）法

是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。19第19页，共95页。20第20页，共95页。

1.共价偶联法中的影响因素

（1）载体的物化性质：要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。

（2）偶联反应的反应条件：必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。

（3）偶联反应的选择：要尽量考虑到酶的其它功能基团所发生的副反应尽可能少。

（4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。21第21页，共95页。优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。

缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。2.共价偶联法的优点、缺点22第22页，共95页。

（四）交联法

共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三维的交联网状结构23第23页，共95页。交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2’-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。24第24页，共95页。

1.共价交联法的四种形式：（1）酶直接交联法：

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。25第25页，共95页。（2）酶辅助蛋白交联：

当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。26第26页，共95页。（3）吸附交联法：

此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。27第27页，共95页。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联28第28页，共95页。29第29页，共95页。（五）四种固定化酶制备方法的特点小结物理吸附包埋法共价结合法共价交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中高中制法特性30第30页，共95页。1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固

3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻

5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价（六）固定化方法与载体的选择31第31页，共95页。

三、固定化酶的性质有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可以再生。能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。32第32页，共95页。33第33页，共95页。（一）影响固定化酶性质的因素

酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：

分配效应

空间障碍效应扩散限制效应34第34页，共95页。

1、分配效应

由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。

35第35页，共95页。

2、空间障碍效应

固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。

36第36页，共95页。37第37页，共95页。

3、扩散限制效应

酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。38第38页，共95页。2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。39第39页，共95页。（二）固定化酶性质的改变1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。

活力下降的原因：

酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。

固定化后的空间障碍效应的影响。

内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。

包埋法时被高分子物质半透膜包围。40第40页，共95页。

2、固定化后酶稳定性提高稳定性提高的原因：

固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。抑制自降解，提高了酶稳定性。41第41页，共95页。

3、固定化酶的作用pH变化（载体及产物）酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。42第42页，共95页。

4、固定化酶的最适温度的变化

酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。43第43页，共95页。

5、米氏常数Km的变化

固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。44第44页，共95页。

（三）固定化酶的活力

固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化学反应的能力。其大小可以用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。它的单位可定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量：用μmol/min·mg或μmol·min-1/cm2

1）活力测定方法分为：

间歇测定：在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。45第45页，共95页。

活力回收=×100%3）固定化酶的半衰期

在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间称为固定化酶的半衰期。以t1/2表示。固定化酶的操作稳定性是影响使用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。

2）固定化酶的活力回收

46第46页，共95页。四、固定化酶反应器5、酶反应器的设计4、酶反应器的选择和使用3、各种酶反应器的特点2、理想酶反应器的要求GoGoGoGoGo6、酶反应器的发展Go1、什么是酶反应器?Go47第47页，共95页。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。1什么是酶反应器？酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。48第48页，共95页。酶催化反应过程示意图过程调控酶反应器

消毒原料预处理

产物分离提纯

产品生物催化剂制备空气除菌能量热量49第49页，共95页。2理想的酶反应器的要求生物反应器设计的主要目标：使产品的质量最高，生产成本最低。评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低。(1)所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。(2)能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(4)应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。(3)应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。50第50页，共95页。3.常见的酶反应器按结构区分搅拌罐式反应器（StirredTankReactor,STR）鼓泡式反应器(bubblecolumnreactor,BCR)填充床式反应器(packedcolumnreactor,PCR)流化床式反应器(FluidizedBedReactor,FBR)膜反应器(MembraneReactor,MR)按操作方式区分分批式反应(batch)连续式反应(continuous)流加分批式反应(feedingbatch)混合形式连续搅拌罐反应器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（BatchStirredTankReactor,BSTR）51第51页，共95页。52第52页，共95页。(1)间歇式酶反应器又称为批量反应器（BatchStirredtankReactorBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。适用的酶：游离酶、固定化酶有搅拌装置的传统形式反应器。由反应罐、搅拌器和保温装置组成。53第53页，共95页。优点：结构简单，不需要特殊设备，适于小规模实验。酶与底物混合充分均匀，传质阻力小，反应条件易控制，能处理胶体状底物、不溶性底物。当前食品和饮料工业有采用这种形式反应器。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶不回收，待反应转化至一定程度后，通过加热或其他方法直接灭酶。缺点:

反应效率低，载体易被破坏，搅拌动力消耗大。间歇式酶反应器54第54页，共95页。(2)连续式酶反应器又称为连续搅拌釜式反应器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶（颗粒状的固定化酶）和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。利于有底物抑制场合.优点：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。反应液出口55第55页，共95页。连续搅拌釜式反应器56第56页，共95页。(3)填充床反应器填充床反应器（PackedReactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床。运转时，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。在其横截面上液体流动速度完全相同，沿流动方向底物及产物的浓度逐渐变化，但同一横切面上浓度一致。又称活塞流反应器。57第57页，共95页。优点：

高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。可使用高浓度的催化剂。与CSTR相比，可减少产物的抑制作用（产物浓度沿反应器长度逐渐增高）。

缺点：①温度和pH难以控制；②底物和产物会产生轴向浓度分布；③清洗和更换部分固定化酶较麻烦。床内压力降大，底物必须在加压下才能进入④传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR旋转填充床58第58页，共95页。(4)流化床反应器流化床反应器（FluidizedBedReactor,FBR）。特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶液，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。59第59页，共95页。优点：具有良好的传质及传热性能，pH、温度控制及气体的供给比较容易；不易堵塞，可适用于处理黏度高的液体；

能处理粉末状底物；即使应用细颗粒的催化剂，压力降也不会很高。

缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大；由于颗粒酶处于流动状态，易导致颗粒的机械破损；流化床的空隙体积大，酶的浓度不高；底物高速流动使酶冲出，降低了转化率。改进：使底物进行循环，提高转化率。将几个流态化床组成反应器组，或使用锥形流态化床。

60第60页，共95页。(5)鼓泡式反应器(bubblecolumnreactor,BCR)利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混和这两种作用的一类反应器。是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。又称为三相流化床反应器。特点：鼓泡式反应器的结构简单，操作容易,剪切力小，物质与热量的传递效率高。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。适用于：游离酶、固定化酶61第61页，共95页。62第62页，共95页。(6)膜反应器膜反应器（membranereactor,MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。适用于游离酶、固定化酶。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。63第63页，共95页。中空纤维膜反应器

由外壳和数以千计的醋酸纤维制成的中空纤维(内径200μm-500μm，外径300μm-900μm)。组成。内层紧密、光滑，具有一定分子量截流值，可截留大分子物质而允许不同的小分子物质通过。外层为多孔的海绵状支持层，酶被固定在海绵状支持层中。反应器的形状为管式或列管式，中空纤维可承受较大压力，通过正常超滤程序将底物压入内壁与海绵状介质上的酶起反应。

MBR膜生物反应器膜片64第64页，共95页。（7）连续搅拌罐—超滤膜反应器

简称CSTR-UFR。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收，底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而失效损失。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。65第65页，共95页。4酶反应器的选择和使用目的：既能充分发挥生物反应的优点，又可克服一些限制因素，以最低的生产成本，获得最高的产量和质量的酶反应器。（1）选择：

固定化酶的形状底物的物理性质酶反应动力学特性酶的稳定性操作要求及反应器费用

66第66页，共95页。

①固定化酶的形状颗粒状或片状固定化酶对连续流搅拌桶式反应器和填充式反应器类型的反应器均可适用。膜状和纤维状的固定化酶适用于填充式反应器。固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，宜采用流动床反应器。如果用填充式反应器，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。67第67页，共95页。

②底物的物理性质底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环反应器或流动床反应器。连续流搅拌桶式反应器只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。68第68页，共95页。③酶反应动力学特性

一般而言，填充床反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合；但在底物抑制的系统中，则连续流搅拌桶式反应器的性能又优于填充床。流动床反应器因其流动特性接近连续流搅拌桶式反应器，故也适宜于底物抑制的反应。69第69页，共95页。

④酶的稳定性在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器最为严重。为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。70第70页，共95页。⑤操作要求及反应器费用

连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。71第71页，共95页。（2）酶反应器使用中应注意的问题酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。如果底物和产物在反应器中不够稳定，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。防止微生物污染酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶从载体上脱落；（3）载体的破碎或溶解。72第72页，共95页。5酶反应器的设计1、确定酶反应器的类型酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照酶反应器的选择原则，选择并确定反应器的类型。2、确定反应器的制造材料由于酶催化反应具有条件温和的特点，通常都是在常温、常压、pH近乎中性的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。3、进行热量衡算酶催化反应一般在30～70℃的常温条件下进行，所以热量衡算并不复杂。温度的调节控制通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。对于某些耐高温的酶，例如高温淀粉酶，可以采用喷射式反应器，热量衡算时，根据所使用的水蒸气热焓和用量进行计算。4、进行物料衡算酶反应动力学参数/底物用量/酶量/反应体积/反应器数量73第73页，共95页。6酶反应器的发展含有辅助因子再生的酶反应器问题由来：

许多酶反应都需要辅因子的协助，如辅酶、辅基、能量供给体等。这些辅因子价格昂贵，需再生循环使用才能降低成本，因而发展了辅因子再生酶反应器。

例：

利用固定化脱氢酶可将固定化NADH再生为NAD。依靠半透膜能将固定化NAD保留在反应器内，实现了NAD的再生与循环使用。74第74页，共95页。2.两相或多相反应器问题由来：许多底物不溶于水或微溶于水，如脂肪、类脂肪或极性较低的物质，进行酶反应时有浓度低，反应体积大，分离困难、能耗大的缺点。解决办法：使酶反应在有机相中进行，可增加反应物浓度，还可减少底物，特别使产物对酶的抑制作用。75第75页，共95页。3.固定化多酶反应器将多种酶固定化后，制成多酶反应器，模拟微生物细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合成各种产物，目前此技术还处于实验阶段，但发展前景良好。1）可组成高效率，巧妙的多酶反应器。2）构建全新的酶化学合成路线，生产人类所需的、自然界不存在的物质。3）代替微生物发酵，用小型柱式反应器取代庞大的微生物发酵罐。4）化工厂、制药厂高大反应塔和密如蛛网的管道将由简单巧妙的生物反应器取代。76第76页，共95页。五、固定化酶的应用GoGoGoGo3.在分析化学中的应用1.在工、农业生产上的应用2.在医药、治疗上的应用77第77页，共95页。1、固定化酶在工农业生产上的应用

产物酶或细胞固定化方法原料L-氨基酸果糖浆6-APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶之菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油78第78页，共95页。产物酶或细胞固定化方法原料类固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸类味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸淀粉酶杆菌肽氢气含脱氢酶及羟化酶的菌体含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌体氨基酰化酶乙酰激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸杆菌与酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum胶格包埋法包埋法载体结合法载体结合法载体结合法角叉胶或聚丙烯酰胺胶包埋聚乙烯氯或多孔砖吸附或海藻酸包埋角叉胶包埋水合氧化钛吸附明胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺或琼脂包埋类固醇前体L-门冬氨酸乙酰-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培养基苏氨酸培养基乙醇培养基

79第79页，共95页。实例：A.葡萄糖异构酶

世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。80第80页，共95页。泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-AlaB.氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶81第81页，共95页。82第82页，共95页。83第83页，共95页。2、固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度

84第84页，共95页。

（1）转入体内发挥作用（口服和注入）

口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将