基因编辑技术2015.12.8

ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats

——ZFN、TALEN、CRISPR/Cas

2023/1/11BiomicsCRISPRteam：陈志飞闫沛涵孟彤余学森王强（非笔画顺序）定义及背景机理简述三大编辑技术CRISPR/Cas优势CRISPR/Cas应用contents定义及背景什么是CRISPRs？CRISPRs全称为规律成簇间隔短回文重复。这是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。Yourtexthere这种基因组编辑技术能够重编程一种CRISPR系统，其有潜力切割任何的特异性DNA靶标。背景1.怀特海德生物医学研究所的创始人

曾在1974年成功构建出第一只转基因小鼠，由此改变了遗传学的研究模式。2.1987年，日本大阪大学的研究人员在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段。机理

核酸内切酶在特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复。近几十年来全基因组测序常规化，在很多的细菌和古细菌中发现了包含CRISPR序列的区域和CRISPR相关(Cas)基因。发现这些短独特序列能与病毒或质粒DNA序列相匹配，表明CRISPR–Cas系统能够编码“适应性”免疫系统。它具有普适应。重要技术ZFN

(Zinc-fingernucleases,ZFN)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）YourtexthereTALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)三大利器ZFN原理ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。TALEN

TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。TALEN原理TALEN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA9全长为34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上FokI核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。101Add

YourTitleCRISPR序列：

细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgenes）

CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统：CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。

11CRISPR/Cas系统CRISPR-Cas9=DNA识别域+核酸内切酶

DNA识别域：向导RNA核酸内切酶：Cas9核酸内切酶向导RNA由两部分组成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端与双链核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合，形成向导RNA。CRISPR/Cas原理CRISPR/Cas过程ZNF成本高昂，效率低。Cas9的效率是TALEN的5倍。sgRNA全长不超过100bp，构建更容易（因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行）可任意对基因组精确定位和改造价格低廉：设计向导RNA的免费软件；美国Addgene机构提供构建CRISPR系统的DNA分子，收费65美元。14CRISPR/Cas9系统优势基因活性调控功能

:免疫系统不宜发现细菌细胞膜脂蛋白成分。因此，该系统除切割噬菌体基因以外，还具有调节细菌基因表达的能力，这是一项新发现。有CRISPR系统的细菌致病力较强。（TimEmoryUniv研究显示，细菌感染哺乳动物细胞时，其CRISPR基因可关闭脂蛋白合成。因此othyR.Sampson,DavidS.Weissetal.ACRISPR-CASsystemmediatesbacterialinnateimmuneevasionandvirulence.Nature,14April2013）Qi等改造Cas9蛋白，其在向导RNA介导下与特定的DNA序列结合，但不切断DNA链，类似于RNAi技术。在细菌中表现为抑制基因转录，但在哺乳动物