实验2重组质粒的提取及鉴定2015

1实验二 重组DNA的提取及酶切鉴定复旦大学基础医学院医学实验教学中心邵红shaohx@2一、实验目的掌握以下方法和技术：1.质粒DNA的小量快速制备2.质粒DNA的限制性内切酶酶切3.DNA的琼脂糖凝胶电泳3二、实验原理

分离质粒DNA有三个步骤：1.培养细菌使质粒扩增2.收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）

3.分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法）1.质粒DNA的小量快速制备4碱变性法抽提质粒DNASolutionIIpH12.6SolutionIIIpH4.8离心后去向染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开不能复性沉淀中质粒DNA氢键部分断裂，cccDNA互补链不完全分离复性上清中5硅基质材料(树脂）与DNA双链相互作用的原理DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液，如TE或水重新水化后，DNA才能从层析柱上定量回收。62.质粒DNA的限制性内切酶酶切

BamHI+XbaI双酶切（酶切完全时）

琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带

3.5kbpSV2载体片段

4.8kbc-myc目的基因片段pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2载体片段3.5kb7 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶3.琼脂糖凝胶电泳89DNA在凝胶中的迁移率的影响因素DNA分子的大小琼脂糖的浓度

DNA的构象

所加电压嵌入染料的存在电泳缓冲液的组成及其离子强度1011不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围琼脂糖凝胶浓度线状DNA分子分离范围（%，m/V）（kb）0.35~600.51~300.61~200.70.8~121.00.5~101.20.4~61.50.2~42.00.1~312

质粒DNA的3种构象琼脂糖凝胶电泳凝胶中1、2、3条带都有可能共价闭合环形DNA开环DNA线性DNA存在复制中间体可能13DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液14 1%琼脂糖凝胶电泳中： 溴酚蓝迁移速率约与300bp的线状双链DNA相同； 二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同增加样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔里使样品呈现颜色在电场中可预知速率（向阳极涌动的染料）15三、实验器材与试剂（详见实验讲义）16四、实验步骤

（详见实验讲义）1.质粒DNA的小量快速制备（AXYGENAxyPrep质粒DNA小量制备试剂盒）注意事项：1.首次使用前，将RNaseA全部加入BufferS1中，4℃贮存2.首次使用前，BufferW2concentrate中加入指定体积的无水乙醇3.使用前检查BufferS2是否出现沉淀，若有应在37℃加热溶解并冷却至室温使用4.自行准备无核酸和核酸酶污染的tip头和离心管5.BufferS2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率17将细菌培养物全部倒入15ml离心管，4500rpm，5min加250μlBufferS1，吹打混匀（也可Vortex）以充分悬浮细菌，转入1.5ml离心管加250μlBufferS2，上下颠倒，温和混匀4~6次使菌体裂解加350μlBufferS3，上下颠倒，温和混匀6~8次，12000g离心10min吸取上清至已置于2ml离心管的制备管中，12000g离心1min，弃滤液同上，在制备管中加500μlBufferW1，12000g离心1min，弃滤液在制备管中加700μlBufferW2，12000g离心1min，弃滤液，重复以BufferW2洗涤（离心）一次，再空离心1次将制备管移入新的1.5ml离心管，在膜中央加60μlEluent或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，即为质粒DNA。避免剧烈摇晃，此步骤不宜超过5min避免剧烈摇晃Eluent液65度温育可提高洗脱效率请保持同步！离心机配平弃上清，沥干，注意细菌沉淀别倒掉了！182.质粒DNA的限制性内切酶的双酶切Buffer42μlBamHⅠ(20U/μl)1μlXbaⅠ(20U/μl)1μlddH2O10μl质粒DNA6μl20μl混匀后短暂离心，37℃水浴1小时注意：加样顺序保证每样试剂加入反应体系乙酰化BSA可不加加样完成后需混匀，短暂离心反应结束后，上样电泳前需短暂离心，再加凝胶加样缓冲液及时将酶放回-20℃冰箱以保证酶的活力19准备好制胶器，插好梳子并保证梳子距底部0.5mm-1.2mm灌胶（事先加GelRed）注意赶气泡待凝准备好凝胶，加热熔解20注意事项：标液面高度以观察水分是否蒸发过多，若溶解后水分蒸发过多，补水2.三角烧瓶上覆打过洞的保鲜膜（防水蒸发）防爆沸和烫伤（带手套）加6μlGelRed后立即灌胶（戴手套）称量agarose加入TAE60ml，勿晃微波炉溶胶注意先做好制胶准备！1%agarose凝胶1%agarose凝胶21在电泳槽内加电泳缓冲液拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面加入6×凝胶加样缓冲液和DNA（1:5比例混合）依次加样，并加好Marker连通电源，80V电泳至溴酚蓝带达到凝胶的1/2处结果观察和记录DNA从阴极向阳极迁移EBr从阳极向阴极迁移（加样后不能移动电泳槽！）22凝胶成像及分析系统233.DNA的1%琼脂糖凝胶电泳制胶：1%agarose，防过热暴沸上样准备（1份凝胶加样缓冲液加5份DNA）上样和电泳:每组上样2个（未酶解质粒和双酶切产物）未酶解质粒10μl+2μl凝胶加样缓冲液双酶切产物20μl+4μl凝胶加样缓冲液Marker5μl,放中间，2组1块胶

各组先做好准备，两组统一集中上样后电泳

电泳槽和电泳仪不可移动24

未酶切酶切未酶切酶切Marker10μl+2μl20μl+4μl10μl+2μl20μl+4μl5μl4.结果观察和记录80~100V电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的1/2至2/3处停止。紫外灯下观察，拍照记录。上样图示：25预期结果未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切实验组双酶切对照组双酶切未酶切质粒Marker26未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切λDNA/HindшMarker-23130-9416-6557-4361-2027-23221%agarose凝胶电泳27发散性思考：为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆（一个细菌来源）的？请例举可能的解释来支持或反对这一说法。为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理上解释，从实验中证明？连接时是否会出现多聚体？思考与疑问：做感受态时，为何要在冰浴下进行？是否还有其他可能原因

为了让细胞膜流动性降低，利于DNA的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性全程在冰浴下进行，反复