选择性荧光探针课件

选择性荧光探针荧光探针的概述荧光探针的设计原理荧光探针的识别原理荧光分子探针的特点文献讲解荧光探针概述荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性的将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置。荧光分子经过特殊的设计，能够选择性识别待测物，再将这种识别信息转换成荧光信号传递给外界，具有这种功能的分子就是荧光探针分子。荧光探针分子的结构荧光探针分子通常由三部分组成：识别基团（receptor）荧光基团（fluorophore）连接体部分（spacer）

识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分子识别枢纽的作用。荧光探针与分子结构的关系荧光探针的性能与探针的共轭体系大小、共轭π键体系的共平面性和刚性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何构型等因素相关。给电子取代基如：-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR和-CN。吸电子取代基如：-C=O，-COOH，-CHO，-NO2和-N=N-。荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的取代，一般指的是卤素(Cl，Br和I)的取代。芳烃取代重原子后，荧光强度一般随卤素原子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。荧光分子探针的设计原理键合-信号输出法置换法化学计量计法1.键合-信号输出法

荧光连接体识别被分析物信号输出基团基团键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。

作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫醚以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醚上的硫原子、席夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2，抑制了席夫碱上C=N键的旋转，实现了荧光从无到有的变化。

2、置换法

识别基团被分析物识别基团荧光基团结合荧光基团结合被分析物

该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来实现对被分析物的检测。识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力，因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。

化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探针本身荧光很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬灭了氟硼荧的荧光，加入氰根离子后，由于铜离子与氰根离子的结合常数更大，从而把作为荧光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶液，荧光恢复，而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根离子的检测。3、化学计量计法

探针分子被分析物新物质A

探针分子被分析物中间体新物质B新物质C（I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物；（II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质。12荧光分子探针识别原理荧光分子探针主要有如下几种识别机理：光诱导电子转移机理（PET,photo-inducedelectrontransfer）分子内电荷转移机理（ICT,intramolecularchargetransfer）荧光共振能量转移机理（FRET,fluorescenceresonanceenergytransfer）形成激基缔合物（excimer/exciplex）1、光诱导电子转移机理（PET）光诱导电子转移体系是由包含电子给体的识别基团部分R，通过间隔基S(如-CH2-)和荧光团F相连而构成的。基于PET机理设计的荧光分子探针，在未结合客体之前，探针分子不发射荧光或荧光很弱，而一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用就会受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。基于光诱导电子转移机理设计的荧光分子探针122、分子内电荷转移分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团上同时连有推电子基团（电子给体）和吸电子基团（电子受体）,通过π键提供电子转移的通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，作为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱发生变化，主要是光谱红移或蓝移。基于分子内电荷转移机理设计的荧光分子探针343、荧光共振能量转移荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光团(供体Doner)的发射光谱和另一个荧光团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定程度的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时(一般小于1000nm)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。4、激基缔合物/复合物如果两个相同的荧光团之间的位置和距离合适，其中一个荧光团被激发以后就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物(excimer)，其荧光发射光谱的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，而一个新的、强而宽的、长波长的无振动精细结构发射峰出现。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。基于激基缔合物设计的荧光分子探针56荧光分子探针的特点荧光探针的荧光必须与生物样品的背景荧光易于区别;荧光探针必须不干扰研究的主体;荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面都有严格的要求。

目前使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类，香豆素类等化合物。罗丹明及其衍生物是一种氧杂蒽类荧光染料，由于苯环间氧桥的存在，从而分子具有刚性共平面结构，使其分子结构稳定性增强，开环状态下，在激发光的作用下能产生强烈的吸收和荧光，其最大发射波长位于500-700nm之间，为红色可见光区，可有效的避开生物体系背景荧光，从而能提高探针的灵敏度，因此是生物分析中经常用到的荧光探针，具有很高的研究和应用价值。罗丹明类

1415罗丹明内酰胺螺环结构具以下特点：1）罗丹明的内酰胺螺环是非共轭结构的，因此在长波长处无吸收，无色，无荧光；2）内酰胺螺环结构在酸性条件或者与被分析物结合后能够诱导罗丹明内酰胺结构开环，氧杂蒽结构电子重新排布，共轭结构恢复，因此在长波长有吸收，有颜色，强荧光。由于此结构的优势，罗丹明内酰胺类衍生物是一类很好的OFF-ON型荧光传感器荧光团。卟啉类卟啉（Porphyrin）是卟吩（Porphine）外环带有取代基的同系物和衍生物的总称。卟吩是由4个吡咯环和4个次甲基桥联起来的18π电子的大环共轭结构，具有平面分子结构和芳香性，不同的卟吩分子其平面性不同，共轭程度也不同。其结构具有以下几个特点：（1）卟吩分子中4个吡咯环的8个β位和4个中位（meso-）的氢原子均可被其它基团所取代。（2）当卟吩环中的两个吡咯上的氢原子被金属离子取代时，形成金属卟啉，其配合物的种类繁多。（3）卟啉是两性化合物，其中两个吡咯环上的氮原子可接受质子，又可以给出质子。（4）卟吩的骨架是非常容易变形的，其分子构型与四个中位（meso-）的取代基有关。卟啉（H2TPP）化合物具有非常好的光学性质，是一种理想的荧光物质，具有高的荧光量子产率、大的Stokes位移、相对长的激发（>400nm）和发射（>600nm）波长，相对长的激发和发射波长能够减少背景荧光的干扰，是一种值得深入研究的离子荧光探针，卟啉直接作为识别基团对某些金属离子有一定响应。卟啉可以与金属阳离子配位形成金属卟啉。而且金属卟啉与自由碱卟啉的吸收光谱和发射光谱又完全不一样。因此，利用不同的卟啉化合物就能直接测定金属离子。时至今日，已有报道卟啉可以用于Zn2+、Cd2+、Li+、Cu2+、Na+、Co2+、Pd2+、Hg2+以及H+的检测等。展望随着荧光探针技术的不断发展和完善,必然会给目前较为热门的基因组学、蛋白质组学、生物芯片以及等药物作用机制等领域带来新的发展契机，提供非常有价值的方法和信息。文献讲解据于罗丹明“关-开”的荧光探针对Fe2+在活细胞成像中具有高选择性BackgroundDuringpastdecades,somesuccessfulattemptshavebeenmadetodevelopselectivefluorescentprobesforFe3+.Unfortunately,therehavebeenrelativelyfewfluorescentprobesforFe2+Ontheotherhand,rhodamine-basedfluorescentprobeswiththeconstructionofa‘‘turn-on’’typehavereceivedincreasinginterestinrecentyearsbecauseoftheirsimplicity,lowdetectionlimit,thecapabilityforspecialrecognitionandexcellentspectroscopicproperties.Highlights•Arhodamine-based“turn-on”fluorescentprobewassynthesizedwithhighyield.•ProbedisplayshighselectivityforFe2+

andastableresponserangeof2–24

μM.•The“turn-on”fluorescenceiscausedbyopen-cyclicmechanismofrhodamine.•ProbeshowsagoodapplicationtomonitorFe2+

inlivingcellsbybioimaging.Resultsanddiscussion探针1（罗丹明）由2（2,6-二乙酰基吡啶）在甲醇中高产量合成1、Selectivityanalysis探针1的最大激发波长为562nm(A);Fe2+具有高选择性(B)2、Jobplotanalysis溶液中探针1:Fe2+=2:1形成络合物时时，工作曲线的拐点为0.67(Fig.2A)；当Fe2+的浓度范围为2–24uM时的荧光强度（Fig.2B）。3、ThepH-controlledemissionmeasurement这个图谱表明自由探针1在不同pH缓冲液下的荧光强度；在pH范围为5.5-8.0时荧光探针1对铁离子具有响应，而荧光强度的变化小于10％。4、Mechanismanalysis罗丹明络合物在构造“关-开”荧光探针时是一个理想的模型，荧光探针1的发光性能对应于“关-开”的荧光信号，这种信号据于螺环和开环之间的转换机制。加入的金属阳离子导致可逆或不可逆的螺环开环反应，Fe2+能结合中间的四个氧原子和乙酰吡啶，从而导致开环。两组协调{O2N2}单位的群体能够满足Fe2+的饱和配位层结构。5、Aserscanningconfocalmicroscopy.（激光扫描共焦显微镜技术）探针1会对活细胞内的Fe2+浓度的变化具