暨南大学高级生理学研究生课程讲义离子通道20091030

离子通道(ionchannel)第一节离子通道概述一、离子通道的分类二、离子通道的结构三、离子通道的特点四、通道的激活五、影响离子转运速率的因素六、通道转运的特点七、K＋、Na+、Ca2+、Cl-通道第二节离子通道研究方法与技术一、膜片钳技术二、通道药理学三、通道蛋白别离、通道重建四、通道蛋白表达水平的检测五、基因结构六、Ｘ射线晶体成像技术第三节离子通道的生理功能第四节离子通道与疾病第五节离子通道的应用及展望TheStructureof

theCellMembrane

TransportofSubstances

ThroughtheCellMembraneSimplediffusionMembraneproteinmediatedtransportEndocytosisandexocytosisSimplediffusionMembraneProteinMediatedtransportFacilitateddiffusionviaCarrierFacilitateddiffusionviaChannelPrimaryactivetransportSecondaryactivetransportSecondaryactivetransportEndocytosisandexocytosis

(needenergyfromATP)EndocytosisPhagocytosis;PinocytosisExocytosis第一节离子通道概述概念：

离子通道是细胞膜上的一类特殊的蛋白质，可以选择性让离子进行跨膜转运。离子通道的发现

1890年，德国物理化学家Wilhelm

Ostwald首先提出，生物体内的电信号是离子进出细胞膜而产生的。1909年诺贝尔化学奖20世纪20年代，科学家证实存在一些供离子出入的细胞膜通道。1950年代初，两位英国科学家Alan

Hodgkin和Andrew

Huxley用枪乌鰂大神经轴突的电压钳等技术发现，钾离子和钠离子进出神经细胞的细胞膜，从而让神经信号传递下去。他们因此获得1963年诺贝尔生理学或医学奖。但那时科学家未知离子通道结构和工作原理。电压钳技术记录膜电流内向电流外向电流0mV

20多年前，德国科学家萨克曼〔BertSakman〕和内尔〔ErwinNeher〕用膜片钳技术发现了细胞膜上单离子通道，发现当离子通过细胞膜上的离子通道的时候，产生十分微弱的电流。他们因此重大成就而获1991年诺贝尔生理学奖。获2003年诺贝尔化学奖的两位科学家是美国人阿格雷〔Peter

Agre〕和麦金农〔Roderick

MacKinnon〕，他们的发现都涉及到了“细胞膜上的通道〞。1998年罗德里克·麦金农利用Ｘ射线晶体成像技术获得了世界第一张离子通道的高清晰度照片，绘制出了世界上第一张离子通道〔钾离子通道蛋白质〕的三维结构图。第一次从原子层次揭示了离子通道的工作原理。这张照片上的离子通道取自青链霉菌。麦金农的方法是革命性的，它可以让科学家观测离子在进入离子通道前在通道中，以及穿过通道后的状态。1980年代中期，阿格雷发现了镶嵌在细胞膜上的一种专门供水分子进出的蛋白质。这种蛋白质就是30多年来科学家一直寻找的“水通道〞——水分子进出细胞的通道。

钾离子通道蛋白质的三维结构图一、分类

门控:控制通道功能状态的通道蛋白分子内部“闸门〞样结构的运动过程根据门控机制的不同而分:

电压门控通道(voltage-gated)化学门控通道(ligand-gated)机械性通道(stress-activated)根据离子选择性的不同而分为：钠通道钾通道钙通道氯通道

closedopenoutinoutin电压门控配体门控extracellularintracellular机械门控membranepotential++++++------++--moleculebindstochannelmechanicalAdaptedfromECBFig12-22;1stEdn1电压门控性通道(voltagegated)---由膜两侧电位差而控制开启和关闭的通道。膜内负电荷减少Na+通道开放胞外Na+进入胞内以最容易通过的离子命名：K+、Na+、Ca2+、Cl-通道4种主要类型。2化学门控通道

(chemicalgated)由化学信号控制开启和关闭的通道。又称配体门控性通道(ligand-gated)由化学物质与通道蛋白质受体分子上的结合位点结合而开启。递质－－－－受体以递质受体命名，如乙酰胆碱受体通道谷氨酸受体通道门冬氨酸受体通道.非选择性阳离子通道(non-selectivecationchannels)是由配体作用于相应受体而开放，同时允许Na+、Ca2+或K+通过。3机械门控性通道(mechanically-gated)是一类感受细胞膜外表应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道。二、通道的结构

〔一〕电压门控通道电压门控钠、钾、钙通道有相似结构:ab亚单位,a

亚单位是形成孔道的单位；a亚单位含Ⅰ-Ⅳ共4个结构域;每个结构域含6个跨膜a螺旋.S1-S6.

结构域Ⅲ和Ⅳ之间有使通道失活的结构

跨膜a螺旋:S1-S6S5和S6共同形成孔道，决定通道的离子选择性和通透性S4是电压传感器，与通道的激活机制有关〔带正电的aa)结构域Ⅲ和Ⅳ之间有使通道失活的结构三、离子通道的特点1、离子选择性

选择性让某种或某些离子通过通道

对离子的选择性取决于：通道、离子的直径离子的种类孔道上带电的氨基酸Ach阳离子通道口径0.65nm,水合K+直径0.396nm,水合Na+直径0.512nm,K+和Na+都可通过通道,孔道外口和内口有带负电的氨基酸,故阴离子不能通过.2、门控性通道开放或关闭取决于：膜电位〔电压门控〕化学信号〔化学门控〕机械刺激〔机械门控〕离子通道不同的功能状态：静息关闭，可激活激活开放失活关闭，不可激活Characteristicsofthevoltage-gatedsodium(top)andpotassium(bottom)channels,showingsuccessiveactivationandinactivationofthesodiumchannelsanddelayedactivationofthepotassiumchannelswhenthemembranepotentialischangedfromthenormalrestingnegativevaluetoapositivevalue.四通道的激活

1跨膜电位差的改变

AP传来,神经未梢膜去极化，电压门控Ca2+通道开放，Ca2+内流，

Ach释放2化学信号分子(递质或第二信使)与特异结合位点〔受体〕结合受体本身即是通道例如在终板膜上：Ach与终板膜Ach受体(化学门控通道)结合；Ach受体阳离子通道开放〔受体构型改变〕；钠内流为主，少量钾外流，产生终板电位；后者扩布使邻近肌膜去极化达阈电位，引发AP。五影响离子转运速率的因素膜两侧离子浓度差和电位差正变膜通道的密度正变膜通道开放的数量正变离子的性质和通道的选择性和通透性六通道转运的特点1.顺电-化学差扩散〔RP和AP的产生〕离子转运的方向:顺化学梯度(从高浓度向低浓度侧)细胞外(mmol/L)细胞内(mmol/L)Na+14512K+4155顺电梯度2.不直接耗能需要Na+-K+泵建立和维持细胞膜内外的离子的电化学梯度

细胞的静息电位

(RestingPotential)静息电位：细胞未受刺激时膜两侧的电位差。RP-10～-100mV安静时膜对钾的通透性较大;钾顺浓度差外流,促使钾外流的钾浓度势能差=阻碍钾外流的电势能差〔钾外流导致的外正内负〕RP相当于Ek。Nernst公式

内外动作电位(actionpotential)膜对Na+通透性增大，Na+内流〔膜外高Na+，膜内负电〕引起AP上升支

钠内流动力:

电驱动力膜内负膜外正化学驱动力膜外高钠钠内流阻力钠内流形成的膜内正外负的电场力Na+-K+泵建立和维持细胞膜内外Na+和K+的化学梯度

泵出3Na+，泵入2K+

七、K＋、Na+、Ca2+、Cl-通道〔一〕K＋通道分二大类：内向优势K＋通道(inwardrectifiersK(ir)〕电压门控K＋通道〔voltage-gatedK(v)〕内向优势K＋通道

：avoltagedrivingacurrentintothecellproducesalargercurrentthananidenticalvoltagedrivingcurrentoutofthecell

时间依赖性失活

电压依从性

电导29pSin145mMK+,3.6pSinnormalK+

高度

K+选择性

存在于骨骼肌细胞、上皮细胞钾离子通道作用:细胞的生物电的产生调节神经递质释放调节心率胰岛素分泌、神经细胞分泌、骨骼肌收缩细胞容积调节K＋通道阻断剂：内向优势K＋通道Cs、Ba2+

电压门控性K＋通道TEA电压依赖性钾电流〔Ikr〕临床应用：抗心律失常药-钾通道阻滞药〔延长动作电位时程药物〕：主要抑制Ikr钾电流，延长心肌细胞动作电位时程，降低自律性，延长有效不应期。〔二〕Na+通道Na+通道是细胞产生动作电位的关键性通道。Na+通道阻断剂：河豚毒〔tetrodotoxin，TTX)普鲁卡因电压依赖性钠电流

Na+通道阻断剂临床应用：抗心律失常药(作用于心肌细胞〕局部麻醉药和抗癫痫药(作用于神经细胞,阻抑AP传导和产生〕Composedofα,β-1andβ-2subunits,but,aswiththecalciumchannel,thelargeα-subunitscarriesmostofthefunctionalproperties.E.g.whenthissubunitisexpressedinXenopusoocytes,avoltage-gated,toxinsensitiveNa+currentisproduced.Theα-subunitisstructurallysimilartoCa2+channels(seeabove)withlongerintracellularlinkingloopsbutashorterC-terminal.Withintheα-subunitamotifof300-400aminoacidsisrepeated4times,eachrepeatedmotifcontains6predictedtransmembranedomains,eachofthe4repeatedmotifshasanS4domaincontainingpositivelychargedresiduesthatactsasthevoltagesensor.ThealphasubunithasthevoltagesensingS4regionineachofthe4repeats.Viewstructure.Theintracellularloopshavephosphorylationsites(P),andtheextracellularloopshaveglycosylationsites(Y)andsaxitoxin(ScTx)andtetrodotoxin(TTX)bindingsites.TheP-segments(a.k.a.H5loops)formtheliningofthepore.Voltage-gatedsodiumchannelsareresponsibleforthecurrentunderlyingtherapidupstrokeofthenerveandmuscleactionpotential.Theyareveryvoltage-sensitive-attherestingpotentialtheopenprobabilityofNa+channelsisverylow.Depolarizationcanincreaseopenprobabilitydramatically-Na+enterscausingfurtherdepolarization,openingmoreNa+channels细胞外Ca2+浓度(1-2mM)显著高于细胞内Ca2+浓度(10-7M)。Ca2+

作为第二信使激活许多生理过程，与递质释放,细胞分泌，收缩，运动等功能密切相关。〔三〕Ca2＋通道Calciumchannelsarecomposedofseveralsubunits.Tenα1subunitshavebeencloned.Voltage-dependentcalciumchannelsexistasacomplexofsubunitsincludingα1,α2,β,γ,andδ.Thesesubunitscontrolthestructureandactivityoftheα1subunit.α1hasmostofthefunctionalproperties.Theα1subunitisstructurallysimilartoNa+channels(seebelow)-withshorterintracellularlinkingloopsbutalongerC-terminal.Withintheα1subunitamotifof300-400aminoacidsisrepeated4times,eachrepeatedmotifcontains6predictedtransmembranedomains,eachofthe4repeatedmotifshasanS4domaincontainingpositivelychargedresiduesthatactsasthevoltagesensor.P-segmentsfromeachrepeatlinethepore.

Atleast6typesofCa2+currenthavebeenidentified:N,L,T,P，QandRN-type:Activation:strongdepolarization,inactivation:slowlocation:presynapticnerveterminals,Majorcontributionincorticalneuronsfunction:involvedin“classical〞transmitterrelease(e.g.ACh,NAdr).Blocker:ωCgTx(omegaconustoxin)P-type:Activation:strongdepolarization,inactivation:veryslow.Blocker:Ftx(funnelwebspidertoxin).Insensitivetodihydropyridines.NowusuallyreferredtoasP/Q-typeT-type:Activation:small(~20mV)depolarizations,Inactivation:rapid(T=transient).location:Widelydistributedinexcitableandnon-excitablecells.Function:Supportpacemakeractivityand,inconjunctionwithIK,Ca,allowoscillationsofmembranepotential.RegulateintracellularCa2+concentration.Blocker:Ni2+.

L-type:

Location:allexcitableandmanynon-excitablecells.Blocker:dihydropyridinesandverapamil.InsensitivetoωCgTx.function:transmitterrelease(peptidetransmitters)inendocrinecells;contractioninheartandsmoothmuscle(E-Ccoupling).Q-type:Activation:strongdepolarizationinactivating:FastLocation:cerebellargranulecells,hippocampalpyramidalneurones,heart,pancreas,pituitaryBlocker:ω-AgaIVAspidertoxinFunction:transmitterrelease,excitation-secretioncouplinginpancreatic.

R-type:

Location:neurones(brain),heart,testes,pituitary.Function:transmitterrelease.Blocker:ωCgTxMVllC.高电压激活的钙通道〔highvoltageactivated，HVA)包括L-,P/Q-,N-,andR-型通道激活需要约50mV以上的去极化。低电压激活的钙通道〔Lowvoltageactivated，LVA)指T-型通道通道激活仅需要约20mV的去极化.

Ca2+作为第二信使激活许多生理过程，与递质释放,细胞分泌，收缩等功能密切相关。钙通道抑制剂的临床应用：

治疗冠心病，心律不齐，高血压ActionpotentialsofCardiacMuscles

andSmoothmuscles1.Ca2＋channels(sodium-calciumchannels)responsibleforthedepolarizationofactionpotentialsinsinusnodecellsoftheheartandinsmoothmusclecells.responsiblefortheformationofAPplateauinventricularandatrialcells.responsiblefortheautorhythmicity.2.

Na+channels:

responsibleforthedepolarizationofactionpotentialsinatrialandventricalcellsoftheheart3.K+channels:

responsibleforthedepolarizationofactionpotentialsTheactionpotentialandionicflowsinaventriclarmyocardialcellNa+inK+outCa2+in,K+outK+outTheactionpotentialandionicflowsinasinusnodecellCa2+inK+outCa2+inCa2+Ca2+Ca2+钙参与形成(临床应用根底):心肌细胞收缩心室肌细胞动作电位平台期钙内流窦房结细胞0期和4期去极化血管平滑肌0期去极化(平滑肌细胞紧张性)〔四〕Cl-通道分类：CLCCFTR(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator)calcium-activatedClchannel(CLCA-n)ligand-gatedanionchannels(GABAAandglycinereceptors)Cl-通道调节物：MDR1,pICln,mat-8,phospholemmanCl-通道参与膜电位的形成,细胞内PH的调节,容积调节,上皮细胞分泌等.1、ClCfamilyClC-0;torpedoelectroplax;10pSClC-1;mammalianmuscle;1pSClC-2;ubiquitous;3-5pSandalsoClC-K1andClC-K2whichareratkindey-specifictranscriptsofClC-2ClC-3;volume-activatedchloridechannel(presentinallcells??)-howeverrecentClC-3-/-knock-outmousestillhasvolumeregulationClC-4;mammalianmuscle,brain,liver,kidney,spleen;140pSClC-5;kidneyClC-6and-7;presentinmosttissuesbutnotfunctionallyexpressedasCl-channels(intracellularorganellechannels)

RecentlythestructureoftheCLCfamilyofchannelshasbeendeterminedbyX-raycrystallographyofabacterialversionoftheprotein.Thereare18α-helicesofwhich17areinthemembrane.Theα-heliceslieatdifferentanglestoeachotherandtothemembranesurfacesotheyhaveavarietyofdifferentlengths.容积激活性氯通道抑制剂：NPPBTamoxifenATPDIDS2囊性纤维化跨膜转导因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)分布：哺乳动物上皮细胞电导：6-10pS功能：上皮细胞液体跨膜转运其基因突变时导致囊性纤维化因cAMP或细胞内的钙升高而激活

12-transmembranedomains,2NBF(nucleotidebindingfolds)and1R-domain(regulatorydomain)3钙激活的氯通道〔ICl,CaandCaCC〕分布：腺细胞、上皮细胞作用：与内分泌腺和外分泌腺分泌有关与上皮细胞跨膜液体转运有关影响神经元和肌细胞的兴奋性卵母细胞受精4g-氨基丁酸促离子型受体

〔g-aminobutyricacid,GABAA〕属配体门控通道，γ－氨基丁酸激活GABAA受体，受体本身是氯通道分布于几乎所有神经元,突触前和突触后作用:介导CNS中的快速突触抑制临床应用：抗惊厥剂，催眠药，肌松药，镇静药苯(并)二氮卓类〔BENZODIAZEPINE〕促进通道开放巴比妥酸盐〔Barbiturate〕延长通道开放时间5甘氨酸受体〔Glycinereceptors〕甘氨酸激活甘氨酸受体(受体本身是氯通道〕主要分布于脊髓和脑干作用：引起抑制α-subunitscontaintheagonistandantagonistbindingsites.拮抗剂：士的宁〔Strychnine〕MDR1MDR与耐药性有关〔药物泵〕。Cl-通道调节物。第二节离子通道研究方法与技术综合应用各种技术：膜片钳技术通道蛋白别离、纯化等生化技术人工膜离子通道重建技术通道药物学基因重组技术Ｘ射线晶体成像技术一、膜片钳技术膜片钳技术是用来测量离子通道跨膜电流和研究分子的非中性跨膜转运的技术。获1991年诺贝尔生理科学奖。膜片钳技术是将尖端直径仅1mm的玻璃微电极接触细胞膜，施加负压使微电极与细胞膜之间形成10G以上的高阻抗封接，使电极尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围环境在电学上隔离，并通过外加命令电压钳制膜电位，对此膜片上的离子通道电流进行监测。两种工作模式：电压钳模式〔voltagemode〕：对细胞进行电压钳制，即利用电子学技术施加一跨膜电压并把膜电位固定于某一数值，从而实验性调节或控制膜片或全细胞电压，可以测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程。研究电压依赖性离子通道。电流钳模式〔currentmode〕：通过电流钳制，改变跨膜离子流来监测细胞膜电位的变化，从而可以观察各种离子通道电流及其调控膜片钳技术的应用：利用药物或改变细胞内外的溶液成分，使其他离子通道失效，即可测定被研究的某种离子通道的功能性参量，分析离子电流的稳态和动力学与膜电位、离子浓度等之间的关系，可推断该种通道的电导、活化和失活速率、离子选择性等，并能测量和分析通道的门控电流的特性。膜片钳技术广泛应用于生命科学各个学科，尤其在递质、激素、药物作用机制研究、寻找药物最正确靶点、新药开发等方面更具有其独特优越性。膜片钳方法glassmicroelectrodeconductingfluidtightsealionchannelcellmembranecell-attacheddetachedpatchmetalwireglassmicroelectrodeconstantvoltagesourcetraceofionchannelcurrentsmetalelectrodeAdaptedfromECBFig12-22

全细胞电流〔容积激活性氯电流〕Whole-cellcurrentsunderisotonicand47%hypotonicconditionsTypicalcurrenttraces,representativeof30cells,recordedunderisotonicbathconditionsandatthepeakofthehypotonicresponseareshowedinAandB.TheprotocolofvoltageclampwasgiveninC.Thevoltagewasheldat0mVandthensteppedto0,40,80mVwithanintervalof4secbetweensteps.250ms2nAB.HypoA.IsoC.0Timecourseofvolume-activatedwhole-cellcurrent

Thevalueofthewhole-cellcurrenttaken10msafterthestartofeachvoltagestep(0,40,80mV)isplottedasafunctionoftime.Similarresultswereobservedin30cells.Currentsinresponsetoallthesevoltagestepsweresmallandstablewhenthecellswerebathedinisotonicsolution(indicatedbythefirstIsobar).Thecurrentsbegantoincreasein1-2minaftertheapplicationofa47%hypotonicsolution(indicatedbytheHypobar).Theactivatedcurrentsreachedthepeakandlevelledoff3-5minaftertheexposuretohypotonicsolutionandthenrecoveredpartiallyafterreturningtotheisotonicsolution(indicatedbythesecondIsobar).Theresidualcurrentswereabolishedbya47%hypertonicsolution(indicatedbytheHyperbar).

单通道记录用特制的玻璃微吸管吸附于细胞外表,使之形成10～100GΩ的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面积为μm2量级,内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的pA〔10-12安培〕量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上别离出来，以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。二、通道药理学研究通道拮抗剂、冲动剂等

区别离子流通道功能

钙通道阻断剂钙电流变化心肌细胞反响药物影响通道的方式:

改变激活延缓或加快通道的失活阻抑离子流动影响电压门控性钠通道的药物及毒素1.通道阻断剂:河豚毒(tetrodotoxin，ＴＴＸ)与神经细胞，肌细胞有高亲合力结合位点在Ｓ５－Ｓ６．2.持续的通道激活：蛙毒〔batrachotoxin〕3.延缓通道的失活蝎毒素a-scorpiontoxins4.改变通道失活的电压依赖性:腰鞭毛虫毒素brevetoxin

TimecourseofNPPBinhibitionofvolume-activatedchloridecurrentsinCNE-2ZcellsThewhole-cellcurrent,measured10msafterthestartofeach200msvoltagestep(0,40,80mV;4sinterval),wasplottedagainsttime.A47%hypotonicsolutionwasintroducedintobath,asindicatedbytheHypobar.Oncecurrentsbegantoplateau,cellswereperfusedwith47%hypotonicsolutioncontaining100mMNPPB,asindicatedbytheNPPBbar.三、通道蛋白别离、通道重建利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道蛋白质从膜上别离下来，经过纯化，然后做通道蛋白质的序列测定。把人工合成或别离的通道蛋白质装在人工膜，观察通道功能。

20世纪80年代中期，美国科学家Peter

Agre发现一种被称为水通道蛋白的细胞膜蛋白就是人们寻找已久的水通道。为了验证自己的发现，Peter

Agre把含有水通道蛋白的细胞和去除了这种蛋白的细胞进行了比照试验，结果前者能够吸水，后者不能。为进一步验证，Peter

Agre制造了两种人造细胞膜，一种含有水通道蛋白，一种那么不含这种蛋白。他将这两种人造细胞膜分别做成泡状物，然后放在水中，结果第一种泡状物吸收了很多水而膨胀，第二种那么没有变化。这些充分说明水通道蛋白具有吸收水分子的功能，就是水通道。四、通道蛋白表达水平的检测Westernblot免疫荧光检测五、研究编码离子通道的基因结构基因定位克隆、聚合酶链反响、Northern、Western、核酸杂交等分子生物学方法。六、Ｘ射线晶体成像技术1998年，罗德里克·麦金农利用Ｘ射线晶体成像技术获得了世界第一张离子通道的高清晰度照片，并第一次从原子层次揭示了离子通道的工作原理。这张照片上的离子通道取自青链霉菌。麦金农的方法是革命性的，它可以让科学家观测离子在进入离子通道前的状态，在通道中的状态，以及穿过通道后的状态。2003年诺贝尔化学奖获得者荧光探针钙图像分析技术荧光探针钙图像分析技术为检测细胞内游离钙离子浓度提供了有效手段，常用的荧光探针有Fura-2/AM、Indo-1/AM、Fluo-3/AM、CalciumGreen等，常用的检测仪器有双波长显微荧光光度计、激光扫描共聚焦显微镜等.第三节离子通道的生理功能容积调节细胞生物电细胞运动细胞收缩细胞分泌细胞周期细胞增殖细胞死亡一、容积调节〔一〕调节性容积回缩(RVD)概念：当细胞处于低渗环境发生肿胀时，诱发细胞自身容积调节过程使细胞容积回缩，趋向于肿胀之前的容积。机理：主要通过激活K+和/或Cl-通道，K+和/或Cl-外流KCl的同向转运体、K+/H+与Cl-/HCO3-交换和Na+/Ca2+交换等。

Swelling-activatedK+andCl-conductanceThefigureillustratesopeningofindependentK+andCl-channelsinducedbyosmoticswellingandaccompanyingoutflowofwater.EffluxofK+,Cl-andwaterresultsindecreaseofcellvolumetowardsthenormallevel.A.IsoB.Hypo3minC.Hypo20min20mMLightmicrographsofCNE-2Zcellsfollowingexposuretoahypotonicsolution

EffectsofCl-channelblockeronRVDinCNE-2ZcellsA47%hypotonicsolutionactivatedRVD(control).TheRVDwasinhibitedbyextracellularapplicationsofCl-channelblockerNPPB(100mM).Theblockerwasaddedtothebathsolutions5minbeforeandduringthehypotonicshocks(indicatedbythebars).Dataaremeanstandarderrorofatleast15cellsfrom5ormoreexperiments.〔二〕调节性容积增大(RVI)概念：当细胞处于高渗环境发生皱缩时，诱发细胞自身容积调节过程使细胞容积增大，趋向于皱缩之前的容积机理：主要通过Na+-K+-2Cl-协同转运、Na+/H+交换和Cl-/HCO3-交换、Na+/K+ATP酶的激活以及Cl-和K+通道的抑制

Shrinkage-activatedNa+-K+-2Cl-cotransport

ThefigureillustratestheactivationofNa+-K+-2Cl-cotransportinducedbycellshrinkageandtheaccompanyinginfluxofwater.ThecellaccumulatesNa+,Cl-

andK+.TheuptakeofNa+,Cl-

andK+andtheinfluxofwaterresultincellvolumeincreasetowardsthenormallevel.Na+-K+pumpextrudestheNa+thatentersduringRVIandintakesK+,tomaintaintheiongradientneedforthecotransportandothercellfunctions,resultinginagainofCl-

andK+bythecell.二、细胞生物电Na+内流安静时K+外流产生静息电位Na+通道开放，Na+内流，产生动作电位三、细胞运动细胞迁移受钙通道，钾通道，氯通道等影响鼻咽癌细胞迁移与氯通道开放有关。氯离子通道阻断剂对CNE-2Z细胞迁移的抑制作用

四、细胞收缩钙是兴奋－收缩耦联的耦联因子。五细胞分泌

兴奋——分泌耦联因子(Ca2+)递质释放等Cl-，K+与液体分泌等有关六细胞周期阻抑氯通道、钾通道使细胞周期停滞于细胞周期G1期.ArrestofproliferatingCNE-2ZcellsinG0/G1phasebyNPPBFlowcytometricanalysiswasusedtodetectthedistributionofcellsindifferentcellcyclephases.Cellswereplatedatadensityof2.5105cellsin25cm2cultureflaskandincubatedfor24h.Thecellswereculturedinthemediumwithout(control)orwith100MNPPBfor2daysandthenharvestedforflowcytometricanalysis.Datarepresent

themeansstandarderrorof4experiments.NotetheincreaseofcellsatG0/G1phaseandthedecreaseofcellsinSandMphases(P<0.01).七细胞增殖氯通道阻抑剂抑制鼻咽癌细胞增殖

EffectsofNPPBoncellproliferationinCNE-2ZcellsCellswereplatedatadensit