电镜冷冻制样技术NEWB

第八章

电镜冷冻制样技术第一节冷冻制样的根底知识一金属投影技术二复型技术三电镜冷冻制样技术概述〔一〕开展概况：1946,Willams建立金属投影技术，主要用于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动物、孢子、别离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和粉末材料。1955，Hall,Huxley提出负染色技术；1959,Horne和Brenner正式命名：Negativestaining，取代了金属投影技术。

一金属投影技术目前金属投影技术主要用于：观察不适合负染色但需要金属投影来提高反差的样品；可用于测量颗粒的大小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善粒子在TEM的可见性；是复型技术、冷冻断裂蚀刻复型技术的根底。1.金属投影技术的概念：把具有高电子密度的金属材料〔Pt，Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一定的角度沉积在样品外表形成投影，从而增加样品的反差，并使图像具有立体感。〔二〕、金属投影根本概念及原理：⑴根本过程：真空蒸发→真空镀膜⑵根本原理：有金属沉积的部位散射能力强，TEM像呈现暗区无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区⑶根本特点：图像反差明显，富有强烈的立体感样品被“包埋〞在金属膜中，即样品外表被金属粒子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样品外表细微机构看不清，只能看到外表形貌。不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，故对病毒样品的纯度要求较高

2.根本原理及特点：真空镀膜仪：10－4～10－5Torr⑴仪器结构真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极〔碳电极、金属电极〕；样品台。真空系统：两级泵真空系统，10－4～10－5Torr加热电流供给系统：大电流变压器，提高40－50A电流。⑵真空的作用：防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。防止样品受到金属氧化而引起的污染。3.所用仪器⑴.具有高电子密度，和较高的电子散射能力⑵.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀，高温下不升华，经久耐用⑶.在电子束作用下，金属不会粒状化⑷.化学稳定，不与样品反响⑸.熔点低，易于蒸发4.选用金属的标准5.常用的金属：⑴Pt，Pd，Pt-Pd,Au,颗粒细10Å用于很小或很薄的生物材料，如病毒、核酸、蛋白质分子等。⑵Cu，Cr〔铬的合金〕，颗粒粗20Å，用于对分辨率要求不高的较大样品，如细菌等1、一次投影

A、样品的准备：制备样品悬液→滴样品液→摆载网→放入真空镀膜仪

B、金属的选取：蒸发材料有粒状、块状、细丝状、薄片状高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C，Pt-Pd合金一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的Cu，Al，Cr〔三〕、方法：C、投影角度θ的调整调整原那么：样品越细小，θ↘，如核酸5～9°，细菌30°病毒、噬菌体12－15°注意：样品与蒸发源的直线距离>10cmD、金属投影先喷3s~4min,厚10~20nm再90°垂直喷碳，加固E、样品颗粒大小的测量

h:颗粒高度θ:投影角度l:照片上投影长度M:放大倍数H:蒸发源的高度L:蒸发源与样品的水平距离2、二次投影一次投影之后，将样品旋转180°，再次投影3、旋转投影:金属蒸发时,样品30～60转/min适于：极小颗粒金属投影的电镜图像样品的颗粒呈黑色，投影区呈白色金属投影与日光投影的比较唯一一种能用TEM观察样品外表方法1、适用范围:金属材料,矿物质、化合物外表坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、孢子、花粉、木材2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料外表结构“铸印〞下来，复制的这层薄膜就是样品外表结构的一个“模子〞，称之为复型〔Replication)。二、复型技术〔一〕、技术概述3、优点：⑴分辨率极高，研究样品外表精细结构；⑵制样简单，不损伤样品，图像具有立体感，⑶在TEM下可以观察样品天然表面或人工断面的细微结构特征。1、一级复型〔负复型〕根本描述：先用有机材料直接在样品外表印制复型，再将复型膜剥离样品，金属投影来增加反差。常用介质：0.5～1%火棉胶醋酸戊酯溶液或0.5%formvar氯仿溶液根本步骤：滴加福尔莫瓦溶液→成膜→漂膜→洗膜→捞膜→金属投影和喷碳加固→观察根本特点：分辨率高，20～50Å，人工假象少；复型膜软，剥离时易变形，且不易与样品别离〔二〕、制样方法2、预投影一级复型根本描述：直接在样品外表进行金属投影和喷碳，制成碳复型膜，再化学法溶解掉样品，将复型膜打捞在载网上。典型方法：石蜡－铬预投影一级复型法根本步骤：准备材料→喷铬喷碳→石蜡补强→溶木材→脱蜡根本描述：用较厚的有机材料在样品外表印制一级复型，剥离后以此为模板，进行金属投影和喷碳，制成二级碳复型，最后溶去一级有机复型膜，留下二级碳复型膜。常用方法：AC纸-C二级复型法根本步骤：贴AC纸→样表结构铸印于AC纸→揭下AC纸〔一级复型〕→用石蜡将AC纸粘于玻板→金属投影与喷碳〔二级复型〕→溶掉AC纸→水浴脱蜡→清洗→捞膜3、二级复型〔正复型〕4、拟复型法和微粒复型法根本描述：用于研究微颗粒材料，将其制成悬浮液，喷到云母片上，枯燥后金属投影，喷碳加固,云母片斜插入10％丙酮溶液，漂浮碳膜，捞膜后电镜观察，此法为拟复型法。假设将膜片转移到溶剂中溶解掉样品，得到该微粒的外表复型膜，即为微粒复型法。病毒荚膜：负染色病毒荚膜：旋转投影病毒荚膜：金属投影(一)、冰冻制样技术的分类冷冻枯燥、冷冻取代、冰冻超薄切片冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等(二)、特点：1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态2、防止了化学药剂对样品产生的影响，减少了样品超微结构和成分的损伤，有利于保护生物大分子活性，用于组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其X－ray微区分析3、操作步骤少，时间短，适于快速研究与诊断三、电镜冷冻制样技术概述1、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造成的一种生物样品精细结构的损伤。2、结冰过程：0～－90℃：六角型晶体－90℃～－140℃：立方体低于－140℃：玻璃态无定形结构〔非晶态〕〔三〕、应用范围：形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其X－ray微区分析领域；其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料〔四〕、冰晶损伤：3、结冰过程与结冰速率①生物样品结冰过程：细胞外结冰：结冰温度较高、速率低细胞内结冰：结冰温度较低、速率高②实验结果说明：冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较大冰晶，损伤细胞结构冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同时形成玻璃态冰，无损伤③结论:防止冰晶形成的关键:提高冷却速率〔103～104℃/s〕、降低冷冻温度4、冷冻剂〔冷媒〕常用：液氮、液态丙烷、氟里昂、液氦，液态乙烷冷冻速率↗冰晶直径↘冷冻损伤↘5、冷冻保护剂★目的：防止冰晶损伤★原理：保护剂与水分结合，减少样品中的水分，从而降低样品的冰冻点★常用的保护剂：甘油、二甲基亚砜〔DMSO〕、蔗糖、乙二醇6、产生冰晶损伤的原因及排除方法▲原因：冷却速率缺乏；样品块过大▲排除方法：①选择优质冷冻剂②使用最正确冷冻装置③剁碎样品④冷冻前用冷冻保护剂处理样品第二节冷冻断裂(蚀刻)和复型技术一技术概况二根本原理三样品的制备1.优点：⑴.防止化学试剂对样品的损伤，保持细胞原有结构。⑵.适于观察和研究细胞膜结构，立体感强，分辨率高⑶.复型膜耐电子束的轰击，可长期保存,是研究生物膜的常规技术一、技术概况

〔－〕技术的特点2.缺点：⑴.冷冻会造成样品人为损伤，冰晶损伤⑵.获取生物膜以外的结构信息缺乏〔二〕应用：主要用于研究生物膜的分子结构，以及观察人及各种动物、植物、微生物细胞的膜结构及细胞器的超微结构。(一)分子生物膜结构的特性1.生物膜的主要化学成分：脂类〔磷脂，胆固醇〕2.脂类分子的结构特点：亲水的头部和疏水的尾部3.脂类分子在水中三种排列：小球分子团，脂双分子，层脂质体二、根本原理(二)断裂的原理断裂总是沿着阻力最小平面进行的即断裂总是从脂双分子层的疏水区裂开(三)蚀刻作用：冷冻蚀刻：样品断裂后，调控温度使之上升,断裂面上冻结的冰直接升华为水而挥发，从而暴露出更深一层结构的一种物理效应。1.蚀刻条件：温度：－100～－110℃真空：1×10－5Torr蚀刻速度：2nm/s时间：15～90s2.蚀刻速度的规那么：温度T↗蚀刻↗真空度↗蚀刻↗(四)复型原理：〔＝2～2.5nm)1、一般方法：先45°喷Pt/C2～5nm后90°喷C7～15nm(加固)2、复型的环境条件真空优于5×10－5Torr温度：－100℃3、间歇喷碳法：喷1s,间歇3～4s,再喷1s,反复4～5次，以防止热辐射损伤(五)冷冻断裂仪简介1.专用冷冻断裂及复型装置EIKO：FD-2A、FD-32.附件型装置：真空喷镀仪＋冷冻断裂装置＋温度控制器三、冷冻断裂(蚀刻)和复型样品的制备

(一)技术准备：

1.电极的准备2.样品冷冻前的预处理⑴取材：活体取下样品1mm3⑵预固定:1%-2%戊二醛固定液固定1－3小时〔戊二醛固定液的温度为生理温度，彻底固定后，冷却到4℃保存1－3h，在没彻底固定之前保存在4℃下会引起膜脂质从细胞膜中别离出来而造成人工假象。〕⑶漂洗：室温下PBS漂洗3次，10min／次⑷冷冻保护：20－30％甘油等溶液渗透8－24h(二〕操作步骤1.冷冻将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品夹中，直接冷冻或间接冷冻。2.真空中断裂5×10－5～1×10－5托，－100－－110℃3.稍加热、蚀刻样品温度从－110℃上升至－100℃，保持15－90s

4.喷镀覆型45°投影喷铂，厚2－5nm，垂直喷碳加固，10－20nm5.复型膜和组织的别离：腐蚀剂：动物：10～30％NaClO植物：铬酸6.清洗、打捞、枯燥复型膜(三)、冷冻断裂复型膜的命名(Branton,1975)1.两个半膜:E半膜〔外半膜〕：连接细胞外空间及细胞内空间(包括内质网腔、核周间隙、线粒体内等)的半膜P半膜〔胞质半膜〕：连接细胞质、核质、线粒体和叶绿体基质的半膜2.四个面：P半膜上的亲水面PS面〔protoplasmicSurface)P半膜上的疏水面PF面〔protoplasmicfractureface)ES(extracellular),EF第三节冷冻超薄切片一技术概况二冷切的根本流程三冷切的总结1.冷冻超切：将样品迅速冷冻,用冷冻超薄切片机进行切片.

2.应用范围:在分子水平研究新鲜组织的超微结构,生物大分子和某些元素的分布组织化学、免疫电镜标记,X-ray微区分析等。

3.关键：防止冰晶损伤游离态的水→玻璃态的冰一、技术概况4.冷切适合的材料：非生物材料：橡胶、胶片、塑料、纸张、纺织品高分子材料生物材料：组织块、细胞团、病毒、生物大分子、微生物5.冷冻超薄切片的难点：防止冰晶损伤排除枯燥损伤⑴、省去经典的超切固定、脱水等过程，实现快速固定，适于快速制片、适于快速研究与诊断。⑵、切片前后防止了化学药剂的处理，样品结构、成分不发生变化，尤其可溶性成分不被抽提，保持了细胞或组织的原始生活状态，使电镜图像更具有接近生物的存活状态。⑶、能很好保存生物大分子活性，有利于组织化学、免疫电镜技术、酶活性、电镜放射自显影、X－ray微区分析等领域中对细胞化学和细胞成分进行定量定性分析。6.冷冻超薄切片的优点：7.所用仪器：冷冻超薄切片机

⑴、仪器准备：专用的冷冻超薄切片：FC-4E,FC-4D配有附件的普通超切机

如：SwedenLKBCryoNoVa,LKB2088

⑵、FC4E性能：a.5min内完成制冷，最低t=-190℃b.灵活调节刀、样品的温度

c.液氮消耗低、自动充盈，连续3hd.切片小室内不结霜，利于操作8.冷切制备程序的分类⑴无溶液制备法：步骤：取材→快速冷冻→切片→枯燥→染色或不染色→镜检；特点：有利于保存生物材料中的可溶性物质及生物大分子的活性和天然构型。应用：可溶性物质的放射自显影、X射线微区分析。⑵固定样品制备法：步骤：取材→醛类固定→样品包封〔夹埋〕→冷冻保护处理→切片→染色→镜检特点：该方法用醛类固定及冷冻保护处理，较好保存细胞的精细结构，应用：适用进行形态学、细胞化学、免疫化学的研究。二、冷切的根本流程〔一〕、取材原那么:快、准、鲜大小:边长0.5－1mm的块〔二〕、醛类固定典型方法：0.1M的二甲砷酸钠缓冲(pH=7.2)的2.5%戊二醛固定液或4％甲醛＋0.5%戊二醛混合固定液固定1h,0－4℃注意：研究的目的和材料不同，固定液的浓度和处理时间可以不同。一般的形态学研究：2.5%戊二醛固定15－60min,4℃做免疫电镜标记时：0.2－1%戊二醛固定5－15min,4℃〔三〕、预包埋(包封、夹埋)包封：采用某些大分子量的支持介质，将组织块包埋起来，以便于切出大面积平整的切片。具体操作：将组织块放入10－20％的明胶溶液中，15－30min,冰箱冷却到4℃，凝固，样品被明胶包封。(四)、冷冻保护处理1.常用试剂：20～60%甘油水溶液20～50%DMSO,5%聚乙烯醇1.6～2.3mol/L蔗糖溶液2.处理时间：5min～3h3.浓度原那么：组织含水量↗，保护剂浓度↗(五〕、冷冻固定1.液氮直接冷冻：1－2S，达－196℃液氦－273℃2.间接冷冻固定〔中间冷媒法〕〔液态丙烷〕3.金属接触法：铜块→液氮中→铜块接触样→样预冷→样入液N4.双丙烷喷气式冷冻法双丙烷喷气式冷冻机RMC

MF72005.高压冷冻法高压冷冻机Leica／Reichert

样品夹放入高压腔中，注入液氮，加压冷冻。高压下2100标大气压下，水的凝聚点降到－22℃，形成冰晶和冰晶生长的速度降低，为组织深层冷冻提供了时间。可以冷冻直径为1mm左右的样品，如真菌芽孢。(六)、切片和捞片1.切片时温度的控制与选择⑴选择切片时样品的温度生物样品T<-35℃,冰晶损伤小⑵细胞内小分子物质和小元素固定下来,T<-80℃⑶形成玻璃无定形水溶液混合相,始终T<-140℃,〔假设T＞-140℃那么样品中无定形固体化的水份发生变形，而且变形不可逆。〕⑷刀温比样品温度高10～20℃⑸根据研究的目的选择样品的温度2.切片的速度和厚度样品温度-60℃～-80℃切速：<0.5mm/s厚度：70～100nm3.刀的选择:(玻璃刀，钻石刀)

注意：

(1)切片之前冷却刀

(2)钻石刀反复使用后需要调整

(3)玻璃刀口上喷钨，增加其锋利性

(4)钻石刀使用后需认真清洗，防止腐蚀

(5)使用玻刀时，用铝铂胶条做水槽，冷的硅胶密封4.修块◆切片机修块法◆预修块法5.切片:(关键：稳定温度〕◆湿刀法：低温下，DMSO做槽液◆干刀法：无槽液，刀角50～70°6、捞片(切片收集)：A干刀法切片的收集(1)液滴法：玻棒粘液→粘切片→在铜网上展片→洗去糖液(2)直接拨取法：拨片到冷铜网上→镜面压平〔此过程维持样品低