实验七、大肠杆菌（Escherichia-coli）紫外线诱变

实验七

大肠杆菌（Escherichiacoli）

紫外线诱变及抗药性菌株筛选环境微生物学实验——综合性设计性试验1、前言（含目的及原理）α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射能够促进遗传物质突变。DNA对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式有DNA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。

波长：200~380nm，诱变最有效的波长253~265nm紫外线诱变常常用于微生物菌种选育.获得有效突变体的前提?挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液选用最适诱变剂量设计和采用高效筛选方案和方法前言（含目的及原理）本实验目的了解物理因素对遗传物质的影响；熟悉紫外线诱变的原理和方法；掌握微生物的紫外线诱变技术。2、材料与方法2.1材料、仪器及试剂菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli）仪器及器皿：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2、材料与方法2.2制备培养基普通培养基平板筛选培养基平板：含抗生素30~80mg/mL。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。2、材料与方法2.3制备菌悬液：106

~108个/mL固体培养法：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌体散开，得到菌悬液。菌悬液浓度用血球计数板计数微生物的血球计数板计数

计数格=4×4=16大格

血球计数板1大格=5×5=25小格1小格=0.05mm×0.05mm=0.0025mm2体积=0.1×0.0025=0.00025mm3=2.5×10-7ml每小格深0.1mm盖玻片载玻片例如数了125个小格中有90个细菌，则

(90÷125)÷(2.5×10-7)=2.88×106个/ml这种方法只能测定个体较大的细菌，细菌个体若太小，则由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡.2、材料与方法2.4、诱变处理：自选诱变剂量和菌液浓度紫外灯：15W，28.5cm，稳定30min。处理强度：以时间为变量10Sec-6min处理方法：适量(5~8ml)菌悬液于培养皿（Φ90mm）中（含无菌大针），置磁力搅拌器上。加盖照射1min，然后打开盖照射。给培养皿加盖可以停止辐射。辐射具有累积效应。2、材料与方法2.5涂布接种

用移液器取适量菌液（0.1~0.2mL）用于涂布培养（有的处理需要稀释至适当浓度后涂布，30~300克隆/皿）。涂布要均匀，培养基表面无液流。（培养基为基本培养基和抗性筛选培养基，每处理设2个重复）37℃培养24后，计数，统计分析。对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化。3、结果与讨论3.1紫外线对大肠杆菌的致死效应(致死率)

以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐标，作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。列公式计算不同辐射剂量下的致死率。3、结果与讨论3.2大肠杆菌抗药性突变计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率。分析不同辐射剂量的诱变效果差异原因。3、结果与讨论

3.3抗药性菌株的筛选与纯化将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上。与对照菌相比较，观察生长状况。3.4结论综合实验结果，得到什么结论？实验要求本实验为综合性设计性实验，4人一组，第十一周完成。查阅相关资料，撰写实验设计报告，第十一周一之前发至wei.s.j@163.com。时间安排十一周完成周二下午制培养基，活化菌种周四下午辐射、涂布培养周五上午观察结果，纯化。十二周周一课间观察划线结果。注意事项无菌操作；对照实验，平行实验；诱变中UV强度的选择（以时间为变