07 流式应用研究进展1112

郑芳流式分子技术（流式细胞术）应用研究进展流式细胞术(flowcytometry,FCM)

是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析新技术,能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选。它是众多不同学术背景、不同科技领域相结合的结晶。它是物理学、生物学、医学等综合运用的产物。流式细胞术2流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点3从流式细胞术的发明、发展直到今天在各个领域应用的拓展,每一步都是诸如电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于它结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。流式细胞术4

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集。流式细胞术5流式细胞术6细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性7采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。工作原理8流式细胞术流式细胞术的基本原理910

前向散射光（forwardscatter,FSC）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。11

侧向散射光（sidescatter,SSC）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。12 测得的FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

13荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光测量14荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)15FSC：反映颗粒的大小SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数16D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。

17免疫细胞的检测免疫细胞的分离流式细胞术18免疫细胞的检测19免疫细胞的检测免疫细胞的计数T细胞及其亚群Th细胞亚群B细胞NK细胞20

CellsurfacemarkersIntracellularcytokinesSortingtoisolatecellpopulations流式细胞仪的基本应用21流式细胞术流式细胞术发展趋势:

①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪;②对流式细胞术检测荧光参数,从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析,目前最多可同时检测15种荧光信号;③从检测参数的相对定量发展为绝对定量;④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软件的自动分析;⑤所采用的荧光试剂,从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂222325流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。流式细胞术在临床中的应用26流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA-B27检查血小板功能及相关疾病27T淋巴细胞及其亚群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析

B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关

B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析28细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析29三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变30CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析五、AIDS病检测中的应用31HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析32流式细胞仪的科研应用免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞活化、细胞因子）磷酸化蛋白的检测干细胞研究/树突细胞研究细胞功能研究（细胞内PH值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位）血小板分析（心脑血管疾病）肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究细胞周期和倍体分析细胞凋亡及凋亡相关蛋白转染&基因沉默效率检测细胞分选、分选后培养及相关生物学研究33近期流式应用研究进展细胞因子检测树突状细胞调节性T细胞34细胞因子检测细胞活化细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞因子36细胞因子病毒、细菌寄生虫、过敏源37细胞因子相关的主要研究领域肿瘤肾炎感染（SARS/禽流感）自身免疫病超敏反应移植排斥反应免疫缺陷病血液疾病基于细胞水平的研究胞内因子胞外因子38胞内因子测定原理：

未活化的细胞所分泌的细胞因子很少，很难在流式细胞仪上检测。需用刺激剂PMA+Ionomycin等激活细胞分泌细胞因子，为了阻止产生的细胞因子分泌到细胞外，需要同时加入BrefedlinA或Monensin等共孵育细胞，使胞内细胞因子蓄积。胞内染色前需用多聚甲醛固定，保留细胞形态完整性和胞内物质抗原性，随后用皂角苷（破膜剂）增加细胞膜通透性，使细胞因子特异性抗体渗入到胞内，达到流式细胞仪检测目的。39树突状细胞

（dendriticcell，DC）DC的生物学特点DC因其具有膜样或树突样突起而得名DC包括郎罕氏细胞、间隙DC、滤泡DC（FDC）、并指DC（IDC）等等。其在体内含量甚微，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的1％以下，但分布非常广泛，在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中都有存在。41DC的生物学功能是一类抗原呈递细胞（APC），将抗原递呈给特殊的初始T淋巴细胞，引发初次免疫反应，在诱导免疫耐受和调控免疫活性方面扮演着重要角色，是机体内惟一能激活初始T细胞的APC。通过激活巨噬细胞，NK细胞和嗜酸性粒细胞引发机体对入侵感染因素的反应，连接天然免疫系统和适应性免疫系统受细胞因子调控的同时,本身也可产生多种细胞因子,如IFN-α,IL-12,GM-CSF,IL-1,IL-6和TNF-α等42DC的表面标志人DC的主要特征性表面标志为CD1a和CD83，CD83还是DC充分成熟的标志。成熟DC高表达CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表达或低表达这些分子未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体43DC的表面标志所有DC共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如HLA-DR。DC成熟过程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面44体外人DC制备前体DC来源外周血单个核细胞/单核细胞密度梯度离心BD™IMagCellSeparationSystem骨髓、新生儿脐带血的CD34+细胞在细胞因子（如GM-CSF，IL-4和TNF-α）的作用下诱导DC体外分化45DC体外诱导分化46树突状细胞分泌的细胞因子DC分泌的细胞因子有很多种，但各种细胞因子与DC功能的相关性尚在探讨中47DC临床和科研应用1肿瘤发生发展机制的探讨肿瘤通过分泌免疫抑制性细胞因子阻止DC成熟，并降低抗原递呈能力导致机体的免疫耐受，使肿瘤细胞逃避宿主免疫反应。DC瘤苗研发将经肿瘤抗原在体外冲击致敏的DC回输体内，再与自体T细胞共育，有利于打破免疫耐受，有效诱导CTL介导的特异性抗肿瘤免疫应答。已用于黑色素瘤，前列腺癌，肾癌，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，妇科肿瘤，恶性脑神经胶质瘤等的临床治疗实验48DC临床和科研应用2病毒感染背景：DCs的功能缺陷也是病毒逃避宿主免疫反应的重要机制，很多病毒的持续性感染（如HBV，HIV）均伴有不同程度的DCs数量减少，表型不成熟（如共刺激分子表达水平下降）及功能的下降，造成感染的免疫耐受，使感染慢性化与对照组和HBV携带者相比，慢性乙型肝炎患者外周血PDC单位数量和功能下降，且PDC数量随病程进展而进行性下降49DC与HIVTheJournalofImmunology,2002,168:4796–4801.PDC↓↓MDC--50DC临床和科研应用3移植物抗宿主反应抑制受者体内DC的成熟，使DC表面的共刺激分子表达下调，抗原呈递能力减弱，从而有助于诱导同种移植免疫耐受，延长移植器官存活时间。过敏和超敏反应肺DC&哮喘：皮肤、肠道和气道中的MDC为未成熟形式，捕捉外来抗原后，携带抗原由外周血迁移到肺，12h内即可在肺纵隔淋巴结的T细胞区出现肺DC，因此在吸入抗原刺激6～24h后MDC在血液中的数量迅速下降，诱导Th2分化（在儿童和特应性成人个体中肺呼吸道对吸入抗原的反应倾向于Th2）自身免疫性疾病51调节性T细胞调节性T细胞（Treg）是一类具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，可分为：天然存在的Treg诱导产生的Treg调节性T分类及生物学特征53天然存在的Treg表型为CD4+CD25int/hiFoxP3+，1995年由Sakaguchi等首次报道，是研究最多的调节性T细胞，是由胸腺T细胞在胸腺内经自身抗原刺激后、经阳性选择自然分化发育形成的，在小鼠和正常人的外周血及脾脏组织中天然存在的CD4+CD25+Treg约占CD4+T细胞群体的5-10%；调节性T分类及生物学特征54天然存在的TregCD4+CD25+Treg一定要经TCR介导信号的刺激才能活化，活化后主要通过接触抑制方式、粒酶B依赖性的细胞杀伤作用抑制CD4+及CD8+T细胞的活化和增殖，从而抑制免疫反应CD25是IL-2R的α链FOXP3（ForkheadboxproteinP3）是天然CD4+CD25+Treg细胞相对特异性的蛋白标记，表达于胞内，该转录因子可调控Treg细胞发育并维持其免疫抑制功能。调节性T分类及生物学特征55诱导产生的Treg