流式细胞仪的操作和数据分析技术

流式细胞仪的操作和数据分析技术流式细胞仪工作站FACSCalibur

每日开机程序1、检查鞘液桶:

鞘液多少管路畅通2、检查废液桶:

空管路畅通3、先打开流式细胞仪4、再打开电脑开关5、气压阀置于加压位置6、standby5-10分钟7、开始实验利用Cellquest软件获取数据点击“苹果”图标在下拉选项中寻找cell-quest软件双击进入软件Cellquest的软件界面工具栏操作步骤：1.点击Acquire，在下拉栏里选择connecttocytometer工具板可用来画图、Region,Marker和文字等。点击选择工具板按钮1.等高图：点击，可画等高图，可自定义图的大小。

2.选择：点击，可选择一个或多个目标，进行改大小或移动。

3.3维图：点击，可画3维图，可自定义图的大小。

4.直方图：点击，可画直方图，可自定义图的大小。

5.密度图：点击，可画密度图，可自定义图的大小。

6.散点图：点击，可画散点图，可自定义图的大小。

7.直方图marker：点击，可在直方图上定位Marker的左边界和右边界。

8.象限marker：点击，可在散点图、密度图和等高图上定位marker。

9.缩小：点击，然后点击图，将放大图缩小到原大小。

10.放大：点击，然后点击图，将缩小图放大到原大小。

11.矩形region：点击，然后在散点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需大小。

12.多边形region：点击，然后在散点图、密度图和等高图中点击形成起始点，然后拖动鼠标画出多边形顶点并在起始点处点击完成多边形region。

13.直方图region：点击，可在直方图上定位region的左边界和右边界。

14.椭圆形region:点击，然后在散点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需大小。

15.箭头：点击，然后在实验文件中点击，拖出直线。

16.文本：点击，然后点击定位插入点并编辑文字。

17.计算器：如果自动重复计算关闭，点击进行数据复计算弹出此对话框说明机器与电脑建立链接操作步骤：1.点击Acquire，在下拉栏里选择connecttocytometer2.再次点击Acquire，在下拉栏里选择parameterdescription操作步骤：1.点击Acquire，在下拉栏里选择connecttocytometer2.再次点击Acquire，在下拉栏里选择parameterdescription3.再次点击Acquire，在下拉栏里选择counters弹出此对话框4.点击cytomter，在下拉栏内选择Dector/amps5.点击cytomter，在下拉栏内选择Threshold6.点击cytomter，在下拉栏内选择stasus7.点击cytomter，在下拉栏内选择compensationDector/AmpsThresholdCompensationstatus1.查看流式细胞仪的运行状态，以利解决仪器运行中出现的问题。

测试脉冲：在FACSCalibur中可从Status菜单中选择FSC：仅FSC探测器上生成的信号、或ALL：所有探测器上生成的信号、或OFF。（注意：只在工程人员指示下可启动此测试信号。）

2.状态：NotReady：激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。Ready：Standby：Standby时仪器的激光器电源降低。

3.激光器电源：以mW表示，在RUN时，15mW；在Standby时，4－6mW。

4.激光器电流：显示激光器电流值，当高于某值时，在显示屏上会出现提示信息5.样本电压：显示样本压力和鞘液压力之间的差异。当插上样本管于上样区时，样本压力和鞘液压力之间的差异增加，该样本电压降低。

6.鞘液：显示鞘液桶是空或OK。7.废液：显示废液桶是满或OK探测器(Detector)：

在流式细胞仪中有二种探测器：光电二极管和光电倍增管(PMTs)。光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管。1.光电二极管用于探测FSC，因为FSC是强信号。可通过电压而选择对FSC信号的不同放大。

E00：将信号放大1(100)倍。

E01：将信号放大10(101)倍。

E02：将信号放大100(102)倍。E03：将信号放大1000(103)倍。

E-1：将信号放大0.1(10-1)倍。

2.光电倍增管(PMTs)用于探测SSC、FL1、FL2、FL3,因它们是弱信号。PMTs的电压调节从150-999。当电压上升时，信号增加，数据出现在道值较高处。可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动。放大器（AmpGain）：可对信号进行微调。对FSC、SSC、FL1、FL2、FL3可设置放大模式和放大增益。若放大模式选择Lin(线性)，放大器的增益可在1－9.99之间调节。可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动。若放大模式选择Log(对数)，放大器的增益则不可调节。对数常用于分开阴性信号和弱阳性信号

阈值（Threshold）：

可用来设置低于该道值的数据信号不被处理，只有高于阈值道数的信号才传送到计算机进行处理。每次只能有一个参数设置阈值(FSC、SSC、FL1、FL2、FL3)。在免疫表型中，在FSC上设阈值。在DNA分析中，在FL2上设阈值。可通过点击上下箭头来选择或直接拖动滑标上下移动。当样本用2色或3色荧光染色时需调节补偿以消除光谱重迭。因荧光素发射一定波段的荧光，因此在探测某种特定荧光素的探测器上有来源于另一种荧光素的荧光信号。FITC主要出现在FL1探测器上，但也有部分重迭到FL2探测器上。PE主要出现在FL2探测器上，但也有部分重迭到FL1和FL3探测器上。补偿调节如下：

FL1－％FL2：从FL1探测器上减去重迭的FL2

FL2－％FL1：从FL2探测器上减去重迭的FL1

FL2－％FL3：从FL2探测器上减去重迭的FL3

FL3－％FL2：从FL3探测器上减去重迭的FL2

注意：补偿调节量依赖于探测器的电压。当补偿过后的群体与阴性群体一致时，补偿调节正确。补偿调节可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动点击图标，跳出下面对话框选择工作模式选择坐标参数名称弹出此图框按照上述同样方法再画一个图框按照上述同样方法再画一个图框散射光荧光将弱信号换成log对数在Parameterdescription内建立存储文件夹在Parameterdescription内建立存储文件夹在Parameterdescription内建立存储文件夹在Parameterdescription内建立存储文件夹在Parameterdescription内建立存储文件夹在Parameterdescription内建立存储文件夹1.调电压，使目的细胞显示在图中图1，FSC放大增益不足；图2，FSC增益太高；图3，SSC电压太低；图4则理想2.选定目的细胞，设门3.调补偿：调去光谱重迭利用Cellquest软件分析数据FACSCalibur

每日关机程序1、10%漂白剂作样品，样品支撑架置于旁位，外管吸入1min2、样品支撑架置于中位，HIRUN内管吸入5min3、样品换成蒸馏水重复1-2步

4、放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上５、退出所有程序，关闭电脑６、standby10分钟后关掉主机

7、记录仪器使用我还等着用那！！！真好用WinMDI2.8分析流式数据WindowsMultipleDocumentInterfaceForFlowCytometry,Version2.8程序全称下载网站适用范围WinMDI程序提供使用者双色或多色分析功能，除了可以制作一维直方图、二维点