第八章有机酸

第八章有机酸

微生物产生的有机酸种类很多，迄今已知约70种，但工业生产的品种还较少。细菌产生的有机酸有：乙酸、丙酮酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、2-酮基-L--酮戊二酸、二氨基庚二酸、聚--羟基丁酸等。

真菌是有机酸的主要产生菌，有些品种已大规模发酵生产，主要有：柠檬酸：柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛用途，而且是一种很好的缓冲剂，尤其是在清凉饮料、果汁、果酱、果冻、糖果等食品中，不可缺少的酸味剂。葡萄糖酸：葡萄糖酸的钙、钠、铵、铁等盐类广泛地用于医药、食品、纺织、皮革等工业上。苹果酸：用于医药和食品工业。丁烯二酸：丁烯二酸的金属盐类可用于某些工业用剂，如除垢剂、润滑剂等。衣康酸：合成树脂或在工业上用作除垢剂等。顺-乌头酸：用于有机合成、酸化防腐剂及树脂合成，是柠檬酸发酵的副产品。五倍子酸：用于医药和印染、鞣革、照相等工业。有不少的有机酸可以用化学合成法生产，而且成本只有发酵法的1/2～1/3，但担心化学合成的物质有潜在的危害，食用的有机酸趋向于用发酵法生产。一、概述二、柠檬酸的生产菌种三、柠檬酸的深层发酵工艺四、柠檬酸发酵的条件五、柠檬酸的合成途径和调节六、柠檬酸的提取第一节柠檬酸发酵

一、概述柠檬酸1784年由Scheels氏发现。1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸。1893年以后，Wehmer发现青霉可以生成柠檬酸。1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸。1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究。

到上世纪50年代柠檬酸的生产绝大部分以发酵法取代了提取法。柠檬酸的消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨。美国柠檬酸年产量约25万吨。我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万吨。但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨。

二、柠檬酸的生产菌种

柠檬酸位于三羧酸循环的起始点，几乎所有微生物都能合成柠檬酸，但能大量积累柠檬酸，并将其分泌到培养基中的微生物不多。柠檬酸的生产菌种最早是采用的青霉，后来发现曲霉，特别是黑曲霉能分泌大量柠檬酸，其它曲霉如泡盛曲霉、温特曲霉、炭黑曲霉、宇佐美曲霉、海枣曲霉、棒曲霉和斋藤曲霉也能积累和分泌柠檬酸，但工业化生产的几乎都是黑曲霉。

其它霉菌中，发现毛霉和一株绿色木霉能分泌柠檬酸，因绿色木霉的纤维素酶活力高，如果提高这类菌的产酸能力，有可能利用它们直接从纤维素原料中生产柠檬酸。石油发酵柠檬酸的优良菌株多属假丝酵母属，但产品中有异柠檬酸。已发现许多细菌如：假单胞菌、节杆菌、棒杆菌、短杆菌、诺卡氏菌等的一些菌株能分泌少量柠檬酸，但这些菌的生长速度、产酸水平和转化率都较低，仍需继续研究探索。①产酸高②周期短③产物单一④营养要求粗放柠檬酸高产菌株选育工作非常重要，选种工作主要集中在：

三、柠檬酸的深层发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面茄子瓶种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）发酵培养（32℃，5～5.5天）成熟的发酵液（或10～20麦芽汁＋0.1%KH2PO4）16％的薯干粉，α-淀粉酶液化

四、柠檬酸发酵的条件(一)营养条件1、碳源：各种含淀粉的原料、淀粉水解物、葡萄糖蜜、蔗糖和甜菜糖蜜等都可作为碳源，我国以薯干粉为原料。一些新菌株采用纯淀粉，浓度可提高至18～22％。2、氮源：最适为0.3～0.4％，薯干等原料含有氮，可不必添加。3、微量元素：1940年以来对微量元素进行了广泛的研究，Cu2、Mn2、Fe3、Zn2、Mo2等为高产所必需，需要量仅在mgkg级，过量可能造成毒害。微量元素中Fe3，Mn2，Cu2三种元素对柠檬酸发酵的影响最为显著，Fe3和Mn2浓度高时抑制柠檬酸的合成，而Cu2对它们有拮抗作用，但高浓度Cu2对柠檬酸的合成也有毒害作用。Cu2

对

Fe3的抵消作用（培养基中加8mg/kg的Fe3）Cu2（mg/kg）柠檬酸产量（％）0－5.042.010.040.020.072.440.067.480.069.2100.081.1注：正常Fe3在0.5mg/kg以下4、其它物质的影响：低级醇类、氟乙酸等可促进柠檬酸的合成。(二)环境条件1、pH：pH≥5.0易形成葡萄糖酸，pH≥3.0易形成草酸，合成柠檬酸pH要降到3以下。2、温度：在不同发酵阶段，一般采用不同的温度控制，在种子培养和发酵初期，以加速菌体增殖为目的，控制较高温度(36～38℃)对黑曲霉的生长有利。发酵产酸期以菌体的产酸代谢为主，控制34～36℃为佳。3、氧：黑曲霉需要较低的氧，但是对氧的缺乏是敏感的。溶氧分压（Pa）耗氧速率（mol/min）产酸速率（mol/min）15900106321320010228935090238000－21500085143900－932007431800630800570500430溶氧对黑曲霉耗氧和产柠檬酸速率的影响由EMP途径合成柠檬酸

C6H12O6＋1.5O2＋11ADP＋11Pi

C6H8O7＋2H2O＋11ATP理论转化率==106.712×6＋8×1＋16×712×6＋12×1＋16×6五、柠檬酸的合成途径和调节由HMP途径合成柠檬酸

6C6H12O6＋13.5O2＋91ADP＋91Pi

5C6H8O7＋16H2O＋6CO2＋91ATP理论转化率==88.9（12×6＋8×1＋16×7）×5（12×6＋12×1＋16×6）×6由EMP途径合成柠檬酸的代谢途径淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖葡萄糖HMP3-磷酸甘油醛ED葡萄糖3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸CO2CO2草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸草酰琥珀酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸苹果酸乙酰CoA乙醛酸乙酸乙酰CoA柠檬酸合成相关的酶系：6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖柠檬酸合成酶丙酮酸＋CO2

草酰乙酸草酰乙酸＋乙酰CoA柠檬酸丙酮酸羧化酶磷酸果糖激酶柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸裂解酶α-酮戊二酸琥珀酸异柠檬酸乙醛酸＋琥珀酸

α-酮戊二酸脱氢酶顺乌头酸酶异柠檬酸α-酮戊二酸异柠檬酸脱氢酶柠檬酸积累的理想条件：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高柠檬酸合成酶的活性4、抑制顺乌头酸酶的活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性柠檬酸合成酶系的调节：顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。异柠檬酸脱氢酶：该酶活性低，有利于柠檬酸的积累。

柠檬酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，一旦柠檬酸积累到一定水平，它就能抑制它自身的进一步分解。-酮戊二酸脱氢酶：现已发现在柠檬酸积累时，真菌中缺乏-酮戊二酸脱氢酶或者是活性非常低。同时还发现，-酮戊二酸脱氢酶的合成是明显地处于葡萄糖与NH4＋的负控制下。异柠檬酸裂解酶：该酶在黑曲霉中存在，并有乙醛酸循环，但在糖质原料发酵时异柠檬酸裂解活性丧失。

以上几种酶的活性，关系到已积累的柠檬酸是否被分解，还有更重要的是如何保持EMP和三羧酸循环不中断，柠檬酸不断被合成。磷酸果糖激酶：是EMP途径的关键酶，它受柠檬酸和ATP的抑制，但它可被AMP、无机磷酸盐和NH4+所激活，NH4＋可有效地解除磷酸果糖激酶受柠檬酸和ATP的抑制。丙酮酸羧化酶：CO2的固定速度直接影响柠檬酸的合成，黑曲霉中丙酮酸羧化酶与其它真核生物的丙酮酸羧化酶相比，不受乙酰CoA的影响，而受-酮戊二酸的抑制，所以它很少受到调节。柠檬酸合成酶：该酶过去被看作是一个受调节的酶，现在认为该酶的作用主要取决于底物乙酰CoA和草酰乙酸的浓度，不存在重要的调节作用。葡萄糖发酵合成柠檬酸时，HMP途径的柠檬酸理论转化率要小于EMP，因此提高EMP途径的比例有利于柠檬酸的合成。黑曲霉生长时，这两个途径的比率是2∶1，而生成柠檬酸时为4∶1，即以EMP占优势。据认为锰的缺乏可以降低HMP途径和三羧酸循环中各种酶的活性。EMP与HMP的比率柠檬酸的提取常采用钙盐法，工艺过程如下：发酵液预处理、过滤清液洗涤菌丝菌丝洗涤水中和见下页碳酸钙六、柠檬酸提取碳酸钙中和废液柠檬酸钙酸解、脱色（浓硫酸、活性炭）硫酸钙、活性炭柠檬酸液离子交换真空浓缩结晶干燥、成品洗涤硫酸钙、活性炭母液洗涤水一、概述二、乳酸的生物合成途径三、乳酸的生产菌种四、乳酸的发酵条件五、乳酸的发酵方法六、乳酸的提取第二节乳酸发酵一、概述

乳酸广泛应用于食品，医药、皮革工业，如饮料、糖果、肉制品、面包等；乳酸钙、乳酸铁、乳酸钠用于医药；乳酸制的聚酯塑料用于外科缝合线及人工假肢等。

乳酸的正式学名是：-羟基丙酸。

乳酸是微生物发酵生产有机酸的第一个产品，开始于1880年，尽管目前有化学合成法生产乳酸，但仍然有50％的乳酸以发酵法生产。1780年，瑞典化学家Scheele在酸牛奶中首先发现了乳酸1841年有乳酸发酵的记载1881年，美国开始工业化生产乳酸1896年，德国人分离出德氏乳杆菌，可利用麦芽汁发酵生产乳酸1901年，日本研究出用甘薯淀粉发酵生产乳酸乳酸发酵的历史：我国乳酸生产1949年以前就有乳酸生产研究的报道1949年以前采用砻糠曲的生产工艺目前采用真菌酶制剂，以大米为原料发酵生产乳酸

1982年的统计，全世界的乳酸产量为28千吨左右，其中：50％用于食品工业，作为酸化剂和防腐剂

20％用于生产L-硬酯酰乳酸酯其余用于医药、制革、纺织等二、乳酸的生物合成途径（一）同型乳酸发酵即经EMP途径产生的丙酮酸，以NADH2为供氢体还原形成乳酸，此过程1分子葡萄糖生成2分子乳酸，理论转化率为100％。C6H12O6+2AMP+2Pi+2NAD2CH3COCOOH+2ATP+2NADH2乳酸脱氢酶CH3COCOOH+NADH2CH3CHOHCOOH+NAD理论转化率＝＝100％2CH3CHOHCOOH

C6H12O6（二）异型乳酸发酵有两条途径，一是6-磷酸葡萄糖酸途径，产生1分子乳酸、1分子乙醇和1分子CO2，理论转化率为50％。二是Bifidus(双歧)途径，2分子葡萄糖产生2分子乳酸和3分子乙酸，乳酸的理论转化率亦为50％。6-磷酸葡萄糖酸途径葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸木酮糖3-磷酸甘油醛乙酰磷酸乙醛乙醇丙酮酸乳酸CO2C6H12O6+ADP+PiCH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+CO2+ATP理论转化率＝＝50％CH3CHOHCOOH

C6H12O6双歧途径2葡萄糖2-磷酸果糖4-磷酸赤藓糖5-磷酸木酮糖3-磷酸甘油醛乙酰磷酸乙酸乙醇2乳酸2-磷酸果糖7-磷酸景天庚糖5-磷酸核糖5-磷酸核酮糖5-磷酸木酮糖23-磷酸甘油醛2乙酰磷酸2乙酸2C6H12O6+5ADP+5Pi2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH+5ATP理论转化率＝＝50％2CH3CHOHCOOH2C6H12O6以戊糖为发酵基质戊糖乳酸5-磷酸木酮糖3-磷酸甘油醛乙酰磷酸乙酸C5H10O5+2ADP+2PiCH3CHOHCOOH+CH3CO