钙成像实验操作及数据处理复习进程

钙成像实验操作及数据处理1.钙成像原理

基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质2.实验操作

操作步骤：（1）Fluo-4工作液配制：每管Fluo-4AM：+8μlDMSO+2μlF-127（2）Fluo-4工作液使用：储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1μlFluo-4工作液主要试剂及仪器：Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜2.实验操作

（3）Fluo-4指示剂孵育：将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000μlFluo-4溶液，37℃孵育20min。（4）清洗：将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄。（5）钙离子成像：使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。以LeicaSP5的CLSM为例：激发光：488nm采用xyt时间轴拍摄模式：Timeinterval：3s；Frames：200（根据实验而定）。

钙成像数据处理必备软件

ImageJMATLABOriginPhotoshopAdobeIllustrator1.图片处理，采集数据

softstiffstiffstiffsoftsoft1.1.新建⽂件夹X，将待分析的组图⽂件（200张）考⼊⽂件夹X中

1.2.导⼊图⽚：打开ImageJ后，File----Import----Imagesequence（会弹出新框SequenceOptions,点OK）

1.3.变换颜色：Image----LookupTables----16_colors（注意：如果是彩色的先转成灰度图）

1.4.调对⽐度：Image----Adjust----Brightness/Contrast（会弹出新框B&C,将图⽚调节到最佳）----Apply（会弹出新框ApplyLUTtoall200[imagenumbers]slicesinthestack?ChooseYES）

1.图片处理，采集数据

softstiffstiffstiffsoftsoft1.5.选细胞：Analyze----Tools----ROIManager（会弹出新框ROIManager）----把ShowallandLabels前⾯打钩----主菜单栏⾥选择选择不同形状⼯具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞）----每圈⼀个细胞后点Add----圈完所有细胞后截屏保存图⽚（PS.保存了标记细胞个数和顺序）⾄新建⽂件夹X中1.6.数据导出：ROIManager----More----MultiMeasure（会弹出新框MultiMeasure）----将MeasureAll200[imagenumbers]Slices打钩----OK----Results（会弹出新框Results）----File----Saveas（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls⾄新建⽂件夹X中）

1.图片处理，采集数据

softstiffstiffsoftsoft1.7.在⽂件夹X中，新建⼀个Excel⽂件，将数据粘贴⾄新的Excel中命名为Results1.xls，只保留编号、Mean、Slice三列，将Area列删除

1.8.ClosetheprogramImageJ

在Analyze里面的SetMeasurements可以设置Mean值2.Matlab数据处理

softstiffstiffsoftsoft2.0.starttheprogramMatlab2.1.复制程序：将程序⽂件CalciumFlow20101105.m拷⼊新建⽂件夹X中，此时⽂件夹X中应包括：原始图⽚⽂件夹、截屏图⽚、Results.xls、Results1.xls、CalciumFlow20101105.m

2.2.导⼊⽂件夹X：打开Matlab后，点右上⾓按钮…，会弹出新框浏览⽂件夹，选中需导⼊的⽂件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现CurrentFolder，列出了⽂件夹X中所有⽂件

2.3.双击打开⽂件夹X中新建的Excel⽂件Results1.xls（切勿打开原Excel⽂件），程序上⽅会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import----ImportData

2.Matlab数据处理

softstiffstiffsoftsoft

2.4.修改程序：双击左侧打开⽂件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语⾔，根据每次图⽚具体情况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、fin=fopen、fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图⽚数（np=），基线baseline（nnp=20，15,10,5）的图⽚数，以及拍摄时间间隔（tstep=）

2.5.运⾏程序：点击运⾏按钮----如若运⾏成功，左侧⽂件夹X中会出现in.txt和out.txt⽂件，则表明运⾏成功，否侧会出现运⾏错误提醒

2.6.ClosetheprogramMatlab

3.Origin数据作图

softstiffstiffsoftsoft3.0starttheprogramOrigins

3.1.打开OriginPro8.5后，File----Import----SingleASCII----弹出新框导⼊⽂件夹X中out.txt⽂件，弹出Book

3.2.点击Book的左上⾓全选后，右击，Plot----Line——Line，弹