实验6细菌鉴定中常用的理化

实验六

细菌鉴定中常用的理化生化反应

3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义

2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。1)了解细菌生理生化反应原理一、实验目的二、实验内容糖（醇）类发酵实验：

1)糖发酵实验，比较大肠杆菌和变形杆菌的糖发酵结果。

2)甲基红实验，比较大肠杆菌和产气杆菌的甲基红反应结果。

3)伏-普实验（V-P实验），比较大肠杆菌和产气杆菌的V-P反应结果。蛋白质、氨基酸及大分子物质代谢实验1）吲哚实验，比较大肠杆菌和产气杆菌的吲哚反应结果2）硫化氢实验，比较大肠杆菌和变形杆菌硫化氢反应结果3）明胶液化实验，比较大肠杆菌和枯草杆菌明胶液化结果4）淀粉水解实验，比较大肠杆菌和枯草杆菌淀粉水解结果有机酸盐及氮盐利用实验1)柠檬酸盐利用实验,比较大肠杆菌和产气杆菌的柠檬酸盐利用结果2)硝酸盐还原实验,比较大肠杆菌和枯草杆菌的硝酸盐还原结果三、实验原理因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。糖（醇）类发酵实验甲基红（Methylred）实验（MR实验）大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色。产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上,故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色.注：甲基红指示剂变色范围pH4.4(红色)-pH6.2(黄色).产气气杆菌：V.P.试验阳性甲基红试验阴性大肠杆菌：V.P.试验阴性甲基红试验阳性伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验)大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物).靛基质(吲哚)实验硫化氢实验

某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性.明胶液化实验细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色.

淀粉水解实验

产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色.

柠檬酸盐利用实验糖发酵实验吲哚实验V.P实验硫化氢反应明胶实验柠檬酸盐实验大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面四、实验仪器、材料和用具实验仪器和用具：恒温培养箱、微生物材料：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂

格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液试剂：试管、无菌平皿、杜氏小管、接种环,酒精灯,培养基1)葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验）.2)葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验）.3)胰蛋白水培养基（吲哚实验）4)柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验）5)明胶培养基（明胶液化实验）6)淀粉培养基（淀粉水解实验）7)柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验）8)硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）1.编号：在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号.五、实验步骤（一）糖(醇)类发酵实验2.接种：取3支葡萄糖发酵培养基,1支接种大肠杆菌，1支接种变形杆菌,留1支不接种，作为对照.3.乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37℃培养箱中培养24h.4.结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH降低,培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。（二）甲基红实验(MR实验)

2.1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌,1支不接种，作为对照。37℃培养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果。1.取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。3.结果：呈现红色者为阳性,呈现黄色者为阴性.取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养48h取出,加入40%KOH5-10滴,然后再加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃培养箱中保温15-30min加快反应速度.若培养物呈现红色,为伏-普反应阳性.

（三）伏-普实验(V.P.实验)

(四）靛基质(吲哚)实验

取3支胰蛋白胨水培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养24-48h后,沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面,观察结果.呈现玫瑰红色为阳性,不变色为阴性.取3支醋酸铁或柠檬酸铁半固体培养基，采用穿刺接种法，1支接种大肠杆菌，1支接种变形杆,1支作对照。37℃培养24h观察结果,若有黑色沉淀线出现为阳性.（五）硫化氢实验取3支营养明胶培养基，用穿刺接种方法，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌,1支作对照。37℃培养48h后,将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min,观察明胶的液化情况。（六）明胶液化实验若明胶不凝固者,表明其已被细菌液化,是为阳性结果.（七）淀粉水解实验1.将冷却到50℃的淀粉培养基以无菌操作制成平板.2.用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边,再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边.3.置37℃温箱培养24h.4.打开平皿,将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板.如菌苔有透明圈出现,表明淀粉已被水解.透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的大小.（八）柠檬酸盐利用实验

取3支柠檬酸盐斜面培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支作对照。37℃培养24h观察结果.培养基变深蓝色者为阳性.培养基不变色,则继续培养5-7天,培养基仍不变色者为阴性.（九）硝酸盐还原实验取3支硝酸盐培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，1支作对照。37℃培养18-96h,每天吸取培养物2ml加格里斯试剂A液和B液1滴,出现粉红色,玫瑰色,橙色或棕色为阳性.如无阳性反应,可加入1-2滴二苯胺试剂,如培养液呈蓝色,则表示培养液中仍有硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其它物质,仍按硝酸盐还原阳性处理.注意:

1.实验时,同时以未接种细菌的培养基作对照.因为亚硝酸盐在自然界分布很广,容易污染试剂.另外,硝酸盐不