植物细胞培养的基本技术

第五章

植物细胞工程制药第四节植物细胞培养的基本技术

植物细胞培养技术的基本技术：

一、植物材料的准备

二、培养基的准备

三、培养方法的选择

一、植物材料的准备1、外植体外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。来源：（1）、生长健壮在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。原因：a、代谢旺盛

b、再生能力强（比较容易培养成功）（2）、不同部位：靠近植株的近基部比较易成功。外植体选取：建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大:易污染，也不需要；材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm——1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。用于植物组织培养的外植体

最重要的是无菌植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。培养前要进行严格的灭菌处理。无杂菌材料来源：种质库（种质库是用来保存种质资源（一般为种子）的低温保存设施。国家种质库是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。）国家种质库外景国家种质库长期库内景

一、植物材料的准备2、外植体的消毒污染的原因污染：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。（1）、从病源菌方面来分析主要有：细菌真菌（2）、从污染的途径而言主要是：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。植物组织培养时

表面处理的常用灭菌剂选择灭菌剂的原则：（1）、

灭菌后易除去或易分解；（2）、

敏感的外植体的灭菌时间不宜过长不敏感的外植体的灭菌时间应适当延长常用灭菌剂的效果比较氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难，且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物细胞。氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌时，可延长到20min或更长时间。植物材料灭菌后，即可进行培养二、培养基及其组成培养基是“无菌土壤”，营养成分可以根据代谢特点进行调控。常用培养基MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、White等。MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。培养基成分

（1）、需要大量无机盐（2）、需要碳源（3）、需要植物生长调节剂（4）、需要有机氮源（5）、需要维生素根据无机离子在细胞内的作用分为四大类：1、大分子的结构成分：主要是C、H、O、N、P、S等；2、各种酶反应所需的主要离子，包括Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、Cl－等；3、各种酶活性所需的基础微量元素，包括：Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+等；4、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、铯、溴等。（1）需要大量无机盐无机盐有大量元素和微量元素之分大量元素：使用浓度大于30mg/L的无机元素包括N、P、S、K、Mg、Ca、Cl和Na微量元素：使用浓度低于30mg/L的无机元素、如Fe、B、Mn、I、Mo（钼），以及极微量的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、Co或Al（2）需要碳源常使用的碳源：糖类、肌醇有时也用甘油等物质代替（3）、需要植物生长调节剂植物生长调节剂：是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括人工合成的具有天然植物激素相似作用的化合物和从生物中提取的天然植物激素。到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种植物激素：生长素（最早被发现的植物激素）分裂素赤霉素脱落酸乙烯生长素：用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。组织培养中常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）：第一个被发现的内源激素，是最先被人工合成的生长调节剂二氯苯氧乙酸（2,4-D）萘乙酸（NAA）吲哚-3-丁酸（IBA）萘氧乙酸（NOA）对氯甲苯乙酸（P-CPA）NAA、IAA、IBA易引起生根2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素：主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：6-苄（biàn）基嘌呤（BAP）6-苄基腺嘌呤（6-BA）激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素（zeatin、zt）异戊稀氨基嘌呤（2-ip）植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例高浓度生长素和低浓度生长素分裂素刺激细胞分裂低浓度生长素和高浓度生长素分裂素刺激细胞生长但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述现象。（4）、需要有机氮源有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。对细胞早期生长有利氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。（5）、需要维生素培养基必须加入B族维生素（B1、B6和泛酸）还需加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷酸肌醇【细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%~8%】极性端的组分）

三、培养方法选择1、培养方法植物细胞/组织培养方法分类：

原生质体培养按培养对象分

单倍体细胞培养

固体培养按培养基类型分

液体培养

悬浮细胞培养按培养方式分

固定化细胞培养固体培养基定义：利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养特点：简便易行、培养所占空间小常用的固化剂：琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶固体培养基固体培养基液体培养定义：把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一种方法。液体培养系统包括：小规模的悬浮培养；大规模的成批培养；半连续培养；连续培养。悬浮培养悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。悬浮培养可分为静止和振荡两类。悬浮培养植物细胞大规模培养系统成批培养法半连续培养法连续培养法固定化培养法1、成批培养将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中，最后一次收获的培养方式。成批培养特点：培养基体积固定培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。成批培养意义：它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。2、半连续培养在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法3、连续培养将愈伤组织培养在一个恒定溶剂的流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持稳定。流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的培养