siRNA干扰整合素β4的表达对MDAMB231乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响

HainanMedHainanMedJ，Dec．2021，V01．24,No．23 海南医学2021年12月第24卷第23期doi：10．3969／j．issn．1003—6350．2021．23．1430siRNA干扰整合都4的表达对MDA—MB一231乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响曹颖，吴倩，文建力，童英(贵州省人民医院病理科，贵州 贵阳550002)【摘要】目的采用RNA干扰(SmallinterferenceRNA，siRNA)技术抑制MDA．MB-231乳腺癌细胞中整合素觯(integrin／34)基因表达，观察其对细胞侵袭和迁移能力的影响。方法选用MDA．MB-23l乳腺癌细胞为研究对象，应用siRNA技术沉默癌细胞Integrin／34mRNA的表达，Real．timePCR和Westernblotting方法分别检测未转染integdnfl4siRNA的乳腺癌细胞组(简称空白对照组)及转染integfin／34siRNA的乳腺癌细胞组(简称Integrin／34RNA干扰组)的Integrin／34mRNA和蛋白表达水平；Transwell实验检测两组细胞的侵袭及迁移能力。结果与空白对照组相比，Integrin／34RNA干扰组Integrinl34的mRNA及蛋白表达水平分别降低了86％(P<0．01)和89％(P<0．01)，细胞侵袭和迁移能力下降(P<O．05)。结论应用siRNA干扰技术抑制Integrin_84表达可使MDA．MB．231细胞迁移及侵袭能力降低，提示IntegrinB4在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。【关键词】乳腺癌细胞；整合素彤；侵袭；迁移【中图分类号】R737．9 【文献标识码】A 【文章编号】 1003---6350(2021)23—3433—04InfluenceofsiRNAsilencingintegrin卢4expressiontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA—bib一231cellline．CA0Ying,WUQian,WENJian-li，TONGYing．DepartmentofPathology,GuizhouProvincmlPeople"sHospital,Guiyang550002，Guizhou,CHINA【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedintegrin／34bysmallinterferenceRNA(siRNA)ontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA·MB一231cellline．MethodsThebreastMDA-MB一23lcelltineswereselected．Integrin／34genewassilencedbyRNAinterferencetechnique，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinMDA—MB——23lcellsnottransfectedwiththeintegrin／34(blankcontrols)andMDA-MB一231cellstransfectedwiththeintegrin／34siRNA(integrinl34siRNA)werestudiedbyreal—timePCRandwesternblotting，respectively．TheabilityofinvasionandmigrationweremeasuredthroughTranswell．ResultComparedwiththeblankcontrols，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinintegrin／34siRNAweredecreasedby86％(P<0．01)and89％(P<0．O1)，respectively,andtheabilityofinvasionandmigrationwerealsodecreasedfP<O．05)．ConclusionSilencingofintegrinf14impairstheabilityinvasionandmigrationofbreastcell，suggestingthatintegrin／34mayplaykeyroleintheinvasivenessandmetastasisofbreast【Keywords】Breastcell；Integrin／34；Invasion；Migration乳腺癌是严重危害女性身心健康的常见恶性肿 键的角色n屯，；其可能参与了调节乳腺癌迁移、侵袭的瘤之一，近年来发病率明显上升。迁移浸润是癌细 关键信号通路p31。为探讨Integrin134在乳腺癌浸润胞恶性程度的重要评价指标之一，具有高迁移浸润 转移中的作用，本研究采用体外合成的小干扰RNA能力的乳腺癌容易复发，预后不良。肿瘤的侵袭机 (SmallinterferenceRNA，siRNA)抑制MDA-MB一231制极为复杂，包括肿瘤细胞的脱离、侵入、附着、侵 乳腺癌细胞Integrin／34的表达，观察其对癌细胞侵袭出、血管生成及其生长。整合素(Integrin)是粘附分 和迁移能力的影响。子中的一类，由a,／3亚单位经非共价键连接而成的异 1材料与方法二聚体跨膜糖蛋白。研究显示，Integrin／34(即Integ— 1．1 主要材料源于人的MDA．MB一231乳腺rinet6／34，简称Integrin／34)可能在肿瘤进展中起到关 癌细胞株购自中南大学湘雅中心实验室；1640培基金工程：贵州省科技厅科研工程(编号：黔科合J字[202112121号)；贵阳市科技局科研工程(编号：筑科合同[2021103137号)通讯曹颖。E-mail：caoyin90417@163．corn·3433·万方数据海南医学2021年12月第24卷第23期海南医学2021年12月第24卷第23期HainanMedJ，Dee．2021，Vol。24,No．23养基、胎牛血清、0．25％胰酶购于HyClone公司；兔 Integrin／34脚．actin蛋白表达。结果用GDS一8000型抗人多克隆抗体Integrin／34(SC一9090)、辣根过氧化 uVP凝胶成像系统照像，以Labworks软件分析结果物酶(HRP)标记的驴抗兔二抗(sc一2313)和驴抗鼠 时以p．actin蛋白条带作为内参照，计算Integrinfl4蛋二抗(sc一2314)、siRNA(sc一35678)、siRNA阴性对照 白条带与届．actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为(SC一37007)、siRNA荧光质控(sc一36869)、siRNA转染 蛋白表达的相对水平。试剂(SC一29528)及siRNA转染培养基(sc一36868)均购 1．2．5 Transwell检测细胞侵袭和迁移能力于SantaCruz公司；鼠抗人口一actin单克隆抗体1．2．5．1Transwell侵袭实验细胞转染同实验(A-1987)购于Sigma公司；SYBPGreenMix购自ABI1．2．2，转染48h后，常规消化细胞，PBS洗两遍，用含公司；Real．timePCR引物由上海基康公司合成；0．I％FBS的无血清培养基混悬、稀释，调整细胞密度Transwelld、室购于美国ComingCostar公司；Matrigel至l×105个／ml。取细胞悬液200ul参加至已铺胶购于BD公司；结晶紫溶液购于Sigma公司。Matrigel胶的8岬孔径Transwelldx室上室，将600肛l1．2方法 含5％FBS的1640培养基参加下室，37℃、5％CO：培1．2．1细胞培养及分组用含10％胎牛血清、 养24h后，取出Transwelldx室，棉签擦去室内未转移1％双抗(青霉素100U／mL，链霉素100U／mL)的1640细胞，95％酒精固定5min，结晶紫溶液染色，PBS洗培养液，5％CO：、37℃培养MDA—MB一231细胞。细2遍，显微镜下观察，随机取5个视野，细胞计数。实胞分组为空白对照组、阴性对照组、Integrin／34RNA验重复3次。干扰组。1．2．5．2Transwell迁移实验Transwell小室不1．2．2 siRNA的转染 生长良好的细胞用 进行Matrigel胶包被，其余实验步骤同Transwell侵袭0．25％胰蛋白酶消化传人六孔细胞培养板中，待其汇实验。合度达80％时按SantaCruz公司转染说明书按不同 1．3统计学方法每组所得结果用均数-4-标准比例进行转染siRNA荧光质控，根据荧光值摸索和 差(孤)表示，结果应用SPSS15．0统计软件进行单因优化siRNA的转染条件。再分别转染Integrin／34 素方差分析，组间比拟采用g检验进行处理，P<0．05siRNA、siRNA阴性对照，转染后6h换正常培养基继 或P<0．01表示差异有统计学意义。续培养48h后收集细胞，并设未转染组作为空白对2结果照，每组均设3个复孑L，重复3次。2．1转染Integrin胆siRNA后Integrin胆mRNA1．2．3 Real．timePCR方法检测Integrin肼mRNA 及蛋白表达水平与空白对照组比拟，Integrin觯表达水平Trizol一步法提取各组细胞总RNA，取RNA干扰组Integfin／34mRNA和蛋白表达水平分3pgRNA样品逆转录eDNA，以cDNA产物为模板 别下降86％(图1A)和89％(图1B)，差异有统计学进行Real．timePCR(SYBRGreenI嵌合荧光法)。 意义(P<0．01)；转染阴性对照组与空白对照组比拟ABl7300型荧光定量PCR仪采集Integfin／34基因及 差异无统计学意义；说明已将Integrin／34siRNA转内参照届．actin扩增各循环荧光信号，以AppliedBio— 入MDA．MB一231细胞，且抑制了Integrin／34mRNAsystemsSDSl4．0软件进行荧光采集和数据分析。 和蛋白水平的表达，瞬时转染Integrin／34基因沉默SDS14．0软件分析其ACt值及RQ(Relativequantity) 细胞构建成功。值，RQ=2一ACt。分析实验结果时以届一actin为内对 2．2转染Integrin／34siRNA后细胞侵袭和迁照，计算Integrin／34mRNA和对照组的相对水平。 移能力变化Transwell侵袭实验结果显示，转染阴Real．timePcR引物序列、PCR产物片断见表l。 性对照组与空白对照组比拟差异无统计学意义；表1Real—timePCR引物序列及PCR产物片断 Integrin／34RNA干扰组与其他两组比拟，穿膜细胞基因 引物序列 扩增产物 数减少，差异具有统计学意义(P<0．05，图2A)；Integrin出上游5’TCATCAAGGAGCAAGCCAGA3’ 273bp Transwell迁移实验结果显示，转染阴性对照组与空下游3’CCGCAGGAGC论AGTCAAC5。 白对照组比拟差异无统计学意义；Integrin／34RNA口一actin上游5’ACTGGAACGGTGAAGGTGACA3。60bp干扰组与其他两组比拟，迁移细胞数减少，差异具下游3’ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC5’有统计学意义(P<0．05，图2B)。结果说明，siRNA1．2．4 WesternBlotting方法检测Integfin／34蛋 干扰Integrin肼基因表达后细胞的侵袭和迁移能力白表达水平WesternBlotting方法检测各组细胞下降。·3434·万方数据海南医学2021年12月第24卷第23期海南医学2021年12月第24卷第23期啪 O口空白对照纽{|||| 吕衄 照性哆纤小．4 组W O 口转染例性对j!{{组奎涛_岂白染昭 衄integrin／34SiRNA㈨ )∞ )∞ )如 )o 丁n㈠㈠㈠U T囫M∽∽川u 乐曲 )一乏、『长一L强矗善蓼三 ，．|l_llllllloll，-Ill，}。上 ^∽M∽M幽integrin阻●——，——。fi-Actin崎嚏鱼蔓一A B图1转染Integrinfl4siRNA后Integrinfl4mRNA(A)及蛋白(B)表达水平壤 针㈨嘲 Ⅻ旧¨如啪一 r---'l空l‘I对_}!{{组四转染阴中i：对照组∞ ㈣一空轮m自染铝差；卅．c嘲时胆照姘纰W 皿皿integrinf；4SiRNA印I_l¨ 鲫_∞_ ∞∞一 一≯二，乓掣磊淫吲 ∞ 一琶}v『，掣熹丢{!一^㈠㈠㈠U一南剀M幽一曷目*赢㈣～。～加_ 加。一一A B图2转染Integrin[34siRNA后细胞侵袭(A)和迁移能力(B)变化注：+表示与空白对照组比拟差异有统计学意义(P<O．05)。3讨论 于细胞膜，导致半桥粒结构消失，细胞骨架重构，肿瘤自1992年HynesH1首先提出细胞外表整合素的变 细胞脱离基底膜，失去极性。增高、游离的整合素口4化较细胞外基质成分更能反映肿瘤细胞及转化细胞黏 扮演着重要的细胞信号转导功能，激活下游信号传导附特性及对细胞侵袭和转移的作用以来，整合素表达 通路，这时的细胞往往表现出较强的增殖能力、迁移改变与肿瘤细胞生物学行为的关系备受重视。大量研 力和侵袭力。究均证明，整合素在肿瘤侵袭和转移的过程中发挥着 Integrin／34在鳞癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、结重要作用01。目前认为，整合索在肿瘤的发生、开展中 直肠癌和胃癌中的表达水平均明显增高，而且与肿瘤主要起两个方面的作用：①整合素介导肿瘤细胞和细 细胞的恶性程度相关。在乳腺癌中，Integrind邱4与胞外基质的粘附，可改变基质的成分，调节基质生物学 癌细胞的转移密切相关，但其作用机制还不清楚。在功能，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移。②整合素介 转移性乳腺癌中IntegrinoW、口3高表达，Integrind6．／3导的异常信息从细胞外基质向细胞内传递，促进了肿 4N表达意味着乳腺癌预后差口，。我们对不同分子亚瘤细胞失控制性生长、肿瘤细胞的去分化与远处转 型乳腺癌中Integrin／34表达研究也显示：具不良预后移。目前研究认为整合素O／亚单位与基质特异性粘附 的三阴性乳腺癌和HER2型乳腺癌Integrin／34呈高表有关，届亚单位那么可能与细胞的信号传导功能有关陋，。 达趋势(数据另文发表)。对乳腺癌转移机制的体外实Integrin／34亚单位和“6亚单位组成异二聚体，是验研究也显示：由Integrin／34介导的细胞间及与细胞上皮细胞半桥粒的主要结构分子。半桥粒是上皮细外基质的相互作用等信号事件在乳腺肿瘤形成、生长、胞“锚钉〞于基质上的结构根底，其主要作用是将上皮侵袭、转移诸多过程中起了重要作用。本研究通过细胞锚定在基底膜上，防止机械力造成的细胞与基底siRNA方法选择性下调Integrin觯的表达，可使高侵袭膜脱离。在多种组织来源的恶性肿瘤细胞中，整合素性乳腺癌细胞株MDA—MB一231迁移及侵袭能力降低，口4的表达水平增高，并且脱离半桥粒结构，游离分布提示Integrin肼在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。·3435．万方数据海南医学2021年12B第24卷第23期海南医学2021年12B第24卷第23期 HainanMedJ'Dec．2021，Voi．24,No．23doi：10．3969／j．issn．1003～6350．2021．23．1431 ·论不同剂量链脲佐菌素建立妊娠糖尿病小鼠模型稳定性比拟雷晨1，张婕2，王琦3(宁夏医科大学总医院教学工作办公室1、检验中心2、肝胆外科3，宁夏银川 750004)【摘要】目的探讨链脲佐菌素方法建立妊娠糖尿病小鼠模型中不同给药剂量对成模率及稳定性的影响。方法将40只C57BL／6J孕鼠随机分为对照组(10只)和实验组(链脲佐菌素低、中、高剂量组，每组lO只)，对照组一次性腹腔注射等剂量的柠檬酸缓冲液，实验组分别予一次性腹腔注射现配链脲佐菌素溶液20mg／kg、50mg／kg、100mg／kg，之后均给予普通饲料喂养，自由进水。分别于妊娠第3、10、18天测空腹血糖与体质量，并观察饮水量与尿量变化，比拟孕鼠成模情况。结果20mg／kgSTZ注射组成模率为40％，50mg／kg链脲佐菌素组成模率为70％，100mg／kgSTZ注射组成模率为50％。空腹血糖与对照组相比拟其高血糖状态持续时间长，且体质量明显下降，差异具有统计学意义(尸<O．05)。结论链脲佐菌素50mg／kg腹腔注射C57BL／6J孕鼠是建立妊娠糖尿病小鼠模型的最正确剂量，具有较好的稳定性。【关键词】链脲佐菌素；妊娠糖尿病；小鼠；模型【中图分类号】R-332 【文献标识码】A 【文章编号】 1003--6350(2021)23—3436_-03Comparisonthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablisbedbydifferentdosesofstreptozotocin．LEIChenl，Zhangfie2．WANGQi3．TeachingOff-zcei．ClinicalLaboratory2。DepartmentofHepatobiliarySurgeryJ，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia，CHINA【Abstract】0bjeetiveToinvestigatetheeffectofdifferentdosesofstreptozotocin(STZ)onthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablishedbystreptozotocin．MethodsFortyC57BL／6Jpregnantmicewererandomlydividedintothecontrolgroup(10mice)andthestreptozotocingroup(20mg&gSTZgroup，50m眺gSTZgroupand100mg／kgSTZgroup，eachwith10mice)．Themicewereinjectedintraperitoneallywithequaldoseofcitratebuffer,STZsolution20mg／kg，50mg／kg，100mg／kg，respectively,accordingtotheirassignedgroups，and基金工程：宁夏自然科学基金(编号：NZl214、NZ07101)；宁夏科技公关工程(编号：2021年)通讯雷晨。E—mail：leichen@medmait．tom．ca一般认为，Integrin是通过各种信号途径把细胞 为乳腺癌药物开发的候选靶点提供一些根底数据。外的信号传人细胞内，再通过激酶链(MAPKJJNK)传 参考文献人细胞核，调节mRNA的转录和蛋白质的表达。同 【l】WilhelmsenK，LitjensSH，SonnenbergA．Multiplefunctionsoftheintegrina6f14inepidermalhomeostasisandtumorigenesis[J】．Mol时细胞外的信号传到细胞骨架蛋白引起细胞变形、移CellBiol，2006，26(8)：2877—2886．动。信号传导有以下途径：(1)对黏着斑蛋白激酶(Fo．【2】LipscombEA，SimpsonKJ，LyleSR，eta1．Thealpha6bem4integrincaladhesionkinase，F阑的激活；(2)对整合素连接蛋maintainsthesurvivalofhumanbreastcarcinomacellsinvivo川．白激酶(