食品质量安全检测新技术

食品质量安全检测新技术

讲课教师：谢远红课程主要内容一.现阶段存在的食品质量安全问题二.食品质量安全问题中检测技术一.现阶段存在的食品质量安全问题1.转基因食品的安全性2.食源微生物的安全性3.生物毒素的安全性4.食品原料中农药、兽药残留的安全性5.抗生素、激素与有害物质残留转基因食品的安全性转基因食品的概念

“转基因”是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。转基因食品（geneticallymodifiedfoods,GM食品）：就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品。转基因食品的发展史转基因食品的发展历史实际上就是基因工程、转基因技术等生物技术的发展史。

1982年，将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精原核内，获得了人类历史上第一个转基因动物——转基因“超级鼠”，比一般的小白鼠大一倍。1983年，世界上第一例转基因植物（一种含有抗生素药类抗体的烟草）在美国成功培植。1994年，孟山都(Monsanto)公司下属Calgene公司研制的延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市，这是发达国家批准商业化的第一个转基因作物。

转基因棉花中国的转基因羊日本研发的转基因大豆

各种各样的转基因水果浙江省种植的转基因油菜

自1996年，转基因农作物获得批准进入田间试验以来，全球转基因作物研发和产业迅猛发展，创造了巨大的经济、社会和生态效应。从此，世界上陆续有国家批准转基因作物的种植，转基因作物的种植面积、种类以及商业效应更是逐年攀升，这就是转基因作物的商业化种植。自1996年转基因作物首次商业化以来，转基因作物面积累计达到近10亿公顷，增长了80倍。

转基因农作物的种植是现代农业发展的重要手段和重要领域。2010年国际农业生物技术应用组织服务（ISAAA）在北京发表2009年度全球生物技术/转基因作物商业化发展态势报告，认为全球第二轮生物技术发展浪潮已经开始。ISAAA报告认为，去年全球生物技术发展一个最显著的进步是中国一项里程式的决策——转基因抗虫水稻和植酸玉米获得生物安全发展证书。水稻和玉米分别是世界上最重要的粮食作物和饲料作物，因此，对二者的生物安全的认证对未来转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的推广有巨大的影响。ISAAA报告显示，去年25个国家的1400万农民种植了1.34亿公顷转基因作物，面积较上一年增长了7%，其中90%来自发展中国家的小型农户。性状面积或“实际面积”达到1.8亿公顷，比2008年增长了1400万公顷。美国（6400万公顷）、巴西（2140万公顷）、阿根廷（2130万公顷）分列转基因作物种植面积的前三位，中国（370万公顷）列第六位。

截止2008年底，我国已经批准22种国外转基因作物进口许可证，分别是转基因大豆GTS-40-3-2，转基因玉米（Mon810，Bt11，Bt176，Mon863，NK603，GA21，T25，MON59122，TC1507，MON88017），转基因油菜（Ms1Rf1、Ms1Rf2、Ms8Rf3、GT73、T45、Oxy235、Tapos19/12）和转基因棉花（Mon531、Mon1445、Mon15985、Mon88913）。2001—2008年年，中国进口口转基因大豆豆累计超过2亿吨。在在中国市场上上70%的大大豆制品中含含有转基因成成分，像大豆豆油、色拉油油、磷脂、酱酱油、膨化食食品等等，进进入中国消费费者的生活转转基因食品主主要是使用转转基因大豆加加工的食用油油和豆制品。。另外在市场场上发现转基基因米粉、饼饼干、咖啡等等，中国正在在接受更多的的国外转基因因食品。羞羞答答的转转基因大豆油油转基因植物的的构建策略作物转入的外外源基因的类类型及方法类型：转基因作物涉涉及的遗传改改良性状主要要包括：抗除草剂基因因占总面积的71%，抗虫基因占28%，抗病毒基因占1%。方法：农杆菌介导法法：农杆菌中有一一种致瘤的环环型DNA，，称为Ti质质粒。被农杆杆菌感染的植植物之所以长长瘤正是由于于T—DNA插入了植物物染色体。从从此，人们便便利用这种天天然的转化体体系向植物转转基因。基因枪：把所要转入的的基因包被在在金粉或钨粉粉上之后，利利用基因枪将将其打入培养养细胞中来完完成转基因过过程。转基因大豆转基因大豆的的研究主要以以耐除草剂和和改善大豆品品质为主：耐除草剂：在美国有3个个转基因大豆豆品种已应用用，最多的是是对除草剂草丁膦和草甘膦具有耐性的２２个品种。2002年种种植面积占美美国大豆的74%。可见，目前美美国的大豆生生产已经基本本上普及了耐耐除草剂的转转基因品种。。改善大豆成分分：Mazur等(1999)获得了种子油酸相对含量高达达85%的大豆新品系系，而且农艺艺性状优良。。转基因玉米转基因玉米的的研究主要集集中于提高抗虫性和耐除草剂方面。在美国，转基基因玉米的种种植面积占玉玉米总种植面面积的比例在在35%左右。其中抗虫Bt玉米米的种植面积发发展最快，所所占近比例最最大，2002年约占玉玉米种植总面面积的24％；耐除草剂玉米占7％—10％之间；兼具抗抗虫和耐除草草剂特性的转转基因玉米品品种种植规模模仍然不大，，近年来仅占占玉米种植总总面积的1％-2％％。转基因水稻转基因水稻的的研究主要集集中在以下三个方面面：提高光合效率率：将C4作物玉玉米的PEPC基因导入入水稻的基因因组，从而改改良了水稻的的光合作用效率率。提高营养品质质：Ye等（2000）成功功地将来自其其他物种的psy、cntl和lcy基因整合到水水稻基因组中中，解决了水水稻胚乳不能能合成维生素A的难题。增加抗逆性：：纽约康乃尔大大学的加戈等等将大肠杆菌菌中两种负责责合成海藻糖的基因导入到到籼稻中。转转基因水稻在在恶劣环境条条件下的生存存能力比普通通水稻更强。。到底我国目前有多少转基因因食品？已经超过2000万吨吨。目前我国极少少生产粮食、、油料作物等等转基因食品品，只有一些些转基因抗虫虫棉，但并不不进入人的食食物链。我国国的转基因食食品基本上都都是进口的。。排在前三位的的是：大豆、、玉米、油菜菜。我国去年年进口大豆3500万吨吨。目前我国国进口大豆主主要用做加工工原料，生产产豆油、豆腐腐、豆奶等制制品。转基因食品的的主要功能1.改善食品品品质和加工工特性2.提高农作作物的抗病虫虫害性能3.提高果蔬蔬产品的耐储储存性和保鲜鲜期4.改善发酵酵食品品质和和风味5.改良动物物性食品品质质转基因作物的的利与弊转基因作物的的带来的效益益ISAAA报报告认为，转转基因作物已已经在以下几几个重要方面面做出了贡献献：（1）保证粮粮食安全，保保证粮食价格格的稳定，解解决发展中国国家人民的饥饥饿问题。世世界人口数量量，特别在发发展中国家，，还在持续增增长，它带来来的粮食短缺缺问题，也就就成为了一个个全世界关注注的重要问题题。因此，通通过基因工程程技术，特别别是转基因技技术，以获得得高产的优良良农作物品种种，可能将是是解决21世世纪不断增加加人口对粮食食需求的重要要途径之一。。（2）创造了了明显的可观观的经济效益益。转基因农农作物的发展展能够带来明明显的经济效效益，如加拿拿大，在1996年种植植了1200万hm耐耐除草剂油菜菜后，产量提提高9％，，经济效益达达600万美美元；中国种种植转基因抗抗虫棉花，从从1997——2000年年的4年，总总的经济效益益达3．37亿美元。在在2000年年世界转基因因作物产品的的价值为3O亿美元，预预计2010年时价值可可达800亿亿美元。由此此可见，经济济效益是十分分明显的。转基因食品的的安全性1.未进行较长时时间的安全性性试验：基因化食品品改变了我们们所食用食品品的自然属性性，它所使用用的生物物质质不是人类食食品安全提供供的部份，未未进行长时间间的安全试验验，无法确定定这类食品是是否安全。英国一位科学学家在著名医医学杂志《柳柳叶刀》上发发表论文，宣宣称实验用的的大鼠在食用用转基因马铃铃薯以后，肝肝脏受到损伤伤，免疫系统统受到削弱，，由此掀起了了国际社会对对转基因食品品安全性广泛泛争论的序幕幕。对人类健康产产生的安全性性问题2产生毒素：基因化食品品能产生不可可预见的生物物突变，会在在食品中产生生较高水平和和新的毒素。。Losey,J.E.等（1999）报道，，在一种植物物马利筋叶片片上撒有转基基因Bt玉米米花粉后，普普累克西普斑斑蝶食用叶片片就少，长得得慢，4天的的幼虫的死亡亡率44%。。而对照组（（饲喂不撒Bt玉米花粉粉的叶片）无无一死亡。转转基因作物产产生的杀虫毒毒素可由根部部渗入周围，，但尚不清楚楚会产生何种种影响，是否否会对人类的的健康产生影影响同样未知知。3过敏或变态反反应：基因技术会会在食品中产产生不能预见见的和未知的的变态反应原原。据报告，，对巴西坚果果产生过敏的的主体也会对对用该坚果基基因工程化而而得到的大豆豆产生过敏。。科学家把巴巴西胡桃的特特性移植到黄黄豆上去，结结果却使一些些对胡桃过敏敏的人在摄取取黄豆时有过过敏的可能。。植物凝血素素（Lectin）对有有些害虫来说说是有毒的，，转基因食品品不得含有此此类有毒物质质。4减少食品的营营养价值或降降解食品中重重要的成份：基因化的目目的是去除或或灭活人们认认为不需要的的物质，这些些物质可能是是未知的。美美国的研究资资料表明，在在具有抗除草草剂基因的大大豆中，异黄黄酮类激素等等防癌的成份份减少了。具具有芳香、有有光泽的红色色蕃茄能贮藏藏几周，但营营养价值较低低。消费者在在购买水果或或蔬菜时，仅仅依靠外观和和质地，因此此，不能准确确判定该产品品的真实质量量。5产生抗菌素耐耐药性细菌：基因技术采采用耐抗菌素素（如抗卡那那霉素、氨苄苄青霉素、新新霉素、链霉霉素等）基因因来标识转基基因化的农作作物，这就意意味着农作物物带有耐抗菌菌素的基因。。荷兰科学家家发表在《新新科学家》杂杂志的试验结结果称，设计计一人造胃，，对人消化转转基因食物的的过程进行模模拟，发现DNA滞留在在肠内，同时时一些转基因因细菌能够把把自己的抗生生素抗性基因因转移给人造造胃的细菌。。6.副作用能对人人体产生危害害：Mayeno,A.N.等（1994）报告告，发生一种种新的，不明明原因的病症症，主要表现现为嗜酸性肌肌痛。临床表表现有麻痹、、神经问题、、痛性肿胀、、皮肤发痒、、心脏出现问问题，记忆缺缺乏、头痛、、光敏、消瘦瘦（Brenneman,D.E.等，1993；Love,L.A.等，1993）。后后查明系日本本一公司生的的基因化工程程细菌产生的的色氨酸所致致。食用者在在3个月后发发病，导致37人死亡，，1500人人体部份麻痹痹，5000多人发生偶偶尔性无力。。据测定，含含量为0.1%便可杀死死人体。1除草剂剂使用用的增增加：科学学家估估计，，基因因化的的农作作物对对除草草剂具具有抵抵抗力力，实实际应应药量量高于于正常常的3倍。。农民民知道道其作作物对对除草草剂有有抵抗抗力，，会大大量使使用除除草剂剂。2杀虫剂剂使用用的增增加：农作作物常常使用用自己己特有有的杀杀虫剂剂，基基因化化的农农作物物对杀杀虫剂剂有抵抵抗力力，这这就意意味着着比以以前有有更多多的杀杀虫剂剂进入入我们们的食食品和和田野野。有有报导导，将将优良良的特特定的的基因因（如如抗杀杀虫剂剂）植植入作作物，，可能能会使使周围围野生生植物物一并并获得得改良良，呈呈现出出抗杀杀虫剂剂的特特征。。对环境境产生生的安安全性性问题题3基因污污染：转基基因作作物通通过基基因流流可使使野生生近缘缘种变变为杂杂草，，成为为“超超级杂杂草””。有有资料料证明明，把把转基基因油油菜释释放后后，当当大田田的油油菜附附近有有近缘缘杂草草时，，在萌萌发的的后代代种子子中有有93%被被证实实是种种间杂杂草。。4对非目目标生生物有有伤害害，对对生物物多样样性形形成威威胁：Birch,A.等（（1996/7）的的实验验结果果表明明，用用转基基因马马铃薯薯饲喂喂蚜虫虫，雌雌虫的的产卵卵量减减少1/3，用用喂转转基因因马铃铃薯长长大的的雄蚜蚜虫与与对照照组蚜蚜虫交交配，，所得得的未未受精精卵数数量多多4倍倍，已已受精精卵在在未孵孵化前前比对对照组组死亡亡率高高近3倍，，以转转基因因马铃铃薯蚜蚜虫为为食物物的雌雌飘虫虫的存存活时时间比比对照照组少少一半半，如如果大大规模模的种种植转转基因因作物物，可可能会会减少少有益益昆虫虫的种种群。。转基因因食品品的检检测技技术转基因因植物物产品品的安安全性性评估估极为为重要要，但但可能能更为为受到到人们们关注注的是是转基基因产产品的的检测测技术术。目目前要要测试试植物物产品品是否否含有有基因因改造造成分分，或或植物物产品品是否否经过过基因因改造造，主主要有有两种种方法法：1检检测测是是否否有有外外来来基基因因或或DNA；；2检检测测是是否否有有外外源源的的蛋蛋白白质质。制订订了了12项项转转基基因因产产品品检检测测行行业业标标准准和和7项项国国家家标标准准；；研研制制并并生生产产了了10种种转转基基因因产产品品检检测测试试剂剂产产品品；；建建立立了了转转基基因因产产品品检检测测信信息息库库和和一一个个转转基基因因产产品品信信息息网网站站。。《大大豆豆中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《玉玉米米中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《油油菜菜籽籽中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《烟烟草草中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《植植物物性性饲饲料料中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《马马铃铃薯薯中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》《棉棉花花中中转转基基因因成成份份定定性性PCR检检测测方方法法》》食源源微微生生物物的的安安全全性性时间间微微生生物物名名称称食食品品源源感感染染人人数数国国家家1984鼠伤寒沙沙门氏菌菌沙沙拉酱美美国国1985鼠伤寒沙沙门氏菌菌巴氏消毒毒奶170000美国1989金黄色葡葡萄球菌菌蘑蘑菇罐头头美美国国1991甲肝病毒毒毛毛蚶300000中国1994肠炎沙门门氏菌巴巴氏消消毒液态态冰激凌凌224000美国1996大肠杆菌菌O157:H7萝卜8000日日本1997 肠炎炎沙门氏氏菌蛋蛋和肉肉制品2013比比利利时2000金黄色葡葡萄球菌菌雪雪印牛奶奶日日本2001 单增增李斯特特菌法法国世界上食食源微生生物感染染群发事事件根据WHO估计计：发达国家家食源性性疾病的的漏报率率在90%以上上发展中国国家食源源性疾病病的漏报报率95%以上上“冰山一一角”沙门氏菌菌（禽、畜畜肉）副溶血性性弧菌（水产品品）蜡样芽孢孢杆菌和和金黄色色葡萄球球菌（剩饭））肉毒梭菌菌（发酵制制品、肉肉制品））单核细胞胞增生李李斯特菌菌（乳制品品、冷藏藏食品））大肠杆菌菌O157:H7（肉制品品）等。。微生物性性食物中中毒常见见的致病病菌和食食物：方法修订订征求意意见文本本GB4789.2菌菌落总总数测定定GB4789.3.1 大肠肠菌群测测定GB4789.3.2 粪大大肠菌群群测定GB4789.3.4 大肠肠杆菌检检验GB4789.10.1金金黄色葡葡萄球菌菌定性检检验GB4789.10.2金金黄色葡葡萄球菌菌定量检检验生物毒素素的安全全性也称作真菌毒素素（Mycotoxins）Mykes:Greekforfungus/mold希腊语““霉菌””Toxicum:Latinforpoison/toxin拉丁文““毒素素”真菌毒素素（Mycotoxin），，有时也也俗称霉霉菌毒素素，是某某些真菌菌产生的的代谢产产物，目目前已发发现的真真菌毒素素有十多多种，它它们包括括黄曲霉霉毒素、、赭曲霉霉毒素、、伏马霉霉素、脱脱氧雪腐腐镰刀菌菌烯酮（（也称为为呕吐毒毒素）、、玉米赤赤霉烯酮酮、T-2毒素素、麦角角碱、杂杂色曲霉霉素、黄黄米毒素素、岛青青霉毒素素、展青青霉毒素素（棒曲曲霉毒素素）、橘橘青霉素素、皱褶褶青霉素素、黄绿绿青霉素素、红矢矢精、黄黄绿素、、圆弧青青霉偶氮氮酸和F-2毒毒素等。。能够产生生真菌毒毒素的霉霉菌1）曲霉属（AspergillusLink）：：黄曲霉霉（A.flavus）、、寄生曲曲霉（A.parasiticus）、、赭曲霉霉（A.ochraceus）、、杂色曲曲霉（A.flavus））、烟曲曲霉（A.flumigatus）、构构巢曲霉霉（A.nidulans）和棒棒曲霉（（A.clavus）等。。2）青霉属（PenicilliumLinkexFr）：：岛青霉霉（P.islandicum））、橘青青霉（P.citrinum）、、红色青青霉（P.rubrum））、展青青霉（P.patulum）和黄黄绿青霉霉（P.citreo-vinide））等。3）镰刀菌属属（FusariumLinkexFr）：：禾谷镰镰刀菌（（F.graminearun））、串珠珠镰刀菌菌（F.moniliforme）、木木贼镰刀刀菌（F.equiseti）、、茄病镰镰刀菌（（F.solani）、三三线镰刀刀菌（F.tritinctum）和镳镳草镰刀刀菌（F.sporotrichioides）等。。玉米上的的曲霉属属（Aspergillus)玉米上的的镰刀菌菌属（（Fusarium)玉米上的的赤霉素素

（Gibberella)Aflatoxin黄曲霉毒毒素ProducedbyAspergillusflavusandA.parasiticus由黄曲霉霉和寄生生曲霉产产生Fivekeyaflatoxins(五种黄曲曲霉毒素素):B1,B2,G1,G2andM1Foundincorn,grains,cottonseed,peanuts,treenuts,spices,milk玉米、谷谷物、棉棉籽、花花生、坚坚果、调调味品、、牛奶中中均已发发现Liverdamage对肝有损损害IARC-class1humancarcinogen国际肿瘤瘤研究机机构定为为一级致致癌物黄曲霉毒毒素的化化学性质质黄曲霉毒毒素的基基本结构构为二呋呋喃环和和香豆素素，在紫紫外线下下，黄曲曲霉毒素素B1、B2发兰色荧荧光，黄黄曲霉毒毒素G1、G2发绿色荧荧光。黄黄曲霉毒毒素M1是黄曲霉霉毒素B1在体内经经过羟化化而衍生生成的代代谢产物物。黄曲曲霉毒素素的分子子量为312-346。难溶溶于水，，易溶于于油、甲甲醇、丙丙酮和氯氯仿等有有机溶剂剂，但不不溶于石石油醚、、己烷和和乙醚中中。一般般在中性性及酸性性溶液中中较稳定定，但在在强酸性性溶液中中稍有分分解，在在pH9-10的强强碱溶液液中分解解迅速。。其纯品品为无色色结晶，，耐高温温，黄曲曲霉毒素素B1的分解温度为为268oC，紫外线对对低浓度黄曲曲霉毒素有一一定的破坏性性。黄曲霉毒素在在各国商品中中的存在情况况(1)商品

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含量范围(μg/kg)玉米印度19972074475-666玉米阿根廷19962271205-560花生印度19962062455-833花生粉印度1995380978-6280棉籽粉英国199721715-25干椰子粉菲律宾1995910023-186巴西果美国1993176170-619Pistachio果芬兰199629592-165黄曲霉毒素在在各国商品中中的存在情况况(2)商品

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含量范围（μg/kg）杏仁美国19934410-372大豆阿根廷199194101-36大米厄瓜多尔19979997-40小麦乌拉圭1996123202-20干无花果奥地利1993136131-350肉豆蔻日本199367430-17Chillies果巴基斯坦1995176661-80Aspergillusflavus黄曲霉五颗表面消毒毒的花生置于于营养培养基基中，其中两两颗有长出黄黄曲霉（黄绿绿色霉菌）黄曲霉毒素的的毒害作用黄曲霉毒素对对天竺鼠肝脏脏的影响，从从上排的最左左边到下排的的最右边，同同一时间内摄摄入的黄曲霉霉毒素量逐步步增加。请注注意：摄入的的黄曲霉毒素素量越大，天天竺鼠肝脏越越苍白。黄曲霉毒素的的毒性1.一级致癌癌物质。2.是氰化钾钾的10-20倍。3.是砒霜的68倍倍。4.是农药1605、1059的28-33倍倍。5.是3，，4-苯并芘芘的4000倍。6.是二甲基基亚硝胺的75倍。黄曲霉毒素引引起的家禽和和家畜中毒症症（一）动物年龄黄曲霉毒素(mg/kg.bw)喂饲时间毒性作用小牛断乳0.22-2.216周发育迟缓、死亡、肝损伤小公牛2岁0.22-0.6620周肝损伤奶牛2岁2.47个月肝损伤鸭0.2346周肝损伤、死亡黄曲霉毒素引引起的家禽和和家畜中毒症症（二）动物年龄黄曲霉毒素(mg/kg.bw)喂饲时间毒性作用猪新生0.2344天发育迟缓猪2周0.1723周厌食、黄疸、腹水、发育迟缓猪4-6周0.41-0.693-6个月发育迟缓、肝损伤鸡1周0.8410周发育迟缓、肝损伤鸡2天0.240天长瘤Ochratoxin赭赭曲霉毒素ProducedbyAspergillusochraceusandPenicilliumviridicatum由赭色曲霉菌和青霉菌产生Foundincerealgrains,coffee,pigproducts,driedvinefruit,wine可在谷物、咖咖啡、猪肉产产品、葡萄干干和酒中发现现Nephrotoxin(kidneytoxin)肾毒素LinkedtoBalkanendemicnephropathy与巴尔干肾病病有关IARC—possiblehumancarcinogen国际肿瘤研究究机构认定为为2B类致癌物物赭曲霉毒素的的化学性质包括7种结构构类似的化合合物。其中赭赭曲霉毒素A(R1=C1，R2=H)毒性最大，在霉变变谷物、饲料等最常见。赭曲霉毒素A是一种无色色结晶化合物物。可溶于极极性有机溶剂剂和稀碳酸氢钠溶液。微溶于于水。其苯溶溶剂化物熔点点94～96℃，二甲苯中结晶熔点169℃。有有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素素A是由多种种生长在粮食（小麦、玉米、大麦麦、燕麦、黑黑麦、大米和和黍类等）、、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物物摄入了霉变变的饲料后，，这种毒素也也可能出现在在猪和母鸡等等的肉中。赭赭曲霉毒素主主要侵害动物物肝脏与肾脏。这种毒素主主要是引起肾肾脏损伤，大大量的毒素也也可能引起动动物的肠黏膜膜炎症和坏死死。还在动物物试验中观察察到它的致畸畸作用。赭曲毒素A在在各种商品中中的存在情况况（1）商品

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含量范围(μg/kg)大麦德国1998679725-27000小麦丹麦1997508050-4550黑麦丹麦19972662910-2124燕麦丹麦19971212042-350小麦瑞士19971533473-2395大麦/小麦英国19972405650-34868绿咖啡日本19973574100-1740赭曲毒素A在在各种商品中中的存在情况况（2）商品

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被分析的样品数

出现率（%）

含量范围(μg/kg)绿咖啡英国1997225050-5787可可粉英国199650100225-37000干果英国19964898600-37650酒德国19966489550-6320调味品/本草植物德国1996317276-7132二.食品质量量安全问题中中检测技术分子生物学检检测技术基因检测免疫学检测化学检测技术术基因检测技术术：1.PCR法2.分子杂杂交法3.基因芯芯片法PCR法PCR的概念念PCR技术的的创建PCR的原理理PCR的反反应体系和和方法PCR的类类型和应用用多聚酶链式式反应（PCR：：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合合酶PCR技术术的创建KaryB.Mullis（穆利利斯（美）））Khorana(1971)等提出在在体外经DNA变性性,与适当当引物杂交交,再用DNA聚合合酶延伸,克隆DNA的设想想。1983年年,Mullis发发明了PCR技术,使Khorana的设想得得到实现。。1988年年Saiki等将耐耐热DNA聚合酶（（Taq））引入了PCR技术术1989年年美国《Science》杂杂志列PCR为十十余项重大大科学发明明之首,比比喻1989年为PCR爆炸炸年,Mullis荣获1993年度度诺贝尔化化学奖。生物样品DNA片段段基因诊断基因治疗基因工程产产品法医学检测测人类学研究究……PCR技术术诞生所依依赖的社会会需求和研研究需要引物引物Mullis的构思思DNA聚合合酶DNA聚合合酶特定DNA片段1983年年94℃变性50-65℃退火XX℃延伸TaqDNA聚合合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年年Saiki等将耐耐热DNA聚合酶（（Taq））引入了PCR技术术72℃94℃55℃PCR循环环PCR技术术的原理1PCR技术的基基本原理无细胞分子子克隆法：：在微量离离心管中,加入适量量的缓冲液液,微量量的模板DNA,四四种脱氧单单核苷酸,耐热性多多聚酶,一一对合成成DNA的的引物,通通过高温变性、低温退火和中温温延延伸伸三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过30次次循循环环,最最终终使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;扩扩增增了了特特异异区区段段的的DNA带带。加热变性复性复温DNA的的变变性性和和复复性性加热热或或强强酸酸、、碱碱性性作作用用可可以以使使DNA双双螺螺旋旋的的氢氢键键断断裂裂,双双链链解解离离,形形成成单单链链DNA,这这称称为为DNA的的变变性性。。解除除变变性性的的条条件件后后,变变性性的的单单链链可可以以重重新新结结合合起起来来,形形成成双双链链,其其原原有有的的特特性性和和活活性性可可以以恢恢复复,这这称称DNA复复性性,也也叫叫退退火火。。PCR扩扩增增原原理理引物物延伸伸延伸伸5’’5’’3’’3’’变性性、、退退火火变性性、、退退火火2PCR技技术术的的特特点点1））高高度度的的灵灵敏敏性性30轮轮循循环环扩增增量量达达230个拷拷贝贝PCR产产物物每每轮轮循循环环增增加加一一倍倍2））特特异异性性引物物引物物引物物的的序序列列及及其其与与模模板板结结合合的的特特异异性性是是决决定定PCR反反应应结结果果的的关关键键。。引物物设设计计的的最最大大原原则则是是最最大大限限度度地地提提高高扩扩增增效效率率和和特特异异性性；；同同时时尽尽可可能能减减少少非非特特异异性性扩扩增增。。引物物设设计计：：（1)序序列列应应位位于于高高度度保保守守区区,与与非非扩扩增增区区无无同同源源序序列列。。（2））引引物物长长度度以以18-30bp为为宜宜。。（3）碱基尽可能随随机分布,G+C占50-60%。。（4）引物内内部避免形成成二级结构。。（5）两引物物间避免有互互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严严格限制。3）操作简便便易行PCR扩增法法,只需要数数小时,就可可以用电泳法法检出1μg基因组DNA中仅含数数个拷贝的模模板序列。通常的DNA扩增法是是分子克隆法法,首先要要构建含有目目的的基因的的载体,然然后将它导入入细胞后进行行扩增,还要要用同位索探探针进行筛选选;这种方法法,要经过DNA内切、、连接、转化化和培养等相相关的过程,操作复杂,一般需要数数周时间。4）用途广广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR的反应应体系和方法法PCR管加热热使模板变性性,退火使使引物与模板板DNA互补补,延伸需将将反应温度升升至中温(72℃),在Tap多聚酶酶的作用下,以以dNTP为原料,以引物为复制的起点点,合成新链链。如此重复改变变反应温度,即高温变性、低低温退火和中中温延伸三个阶段为一一个循环,每每一次循环使使特异区段的的基因拷贝数数放大一倍,一般样品是是经过30次循环,最终使基因因放大了数百百万倍;将将扩增产物进进行电泳,经经溴化乙锭染染色,在紫外外灯照射下肉肉眼能见到扩扩增特异区段段的DNA带带。总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶酶1反应体系系PCR技术的的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程程PCR技术的的基本过程(2)Taq酶酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪仪94℃℃55℃℃72℃℃Taq酶酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃℃5～7min循环25～～35次琼脂糖凝胶电泳PCR技术术的基基本过过程(3)1）PCR反应应成分分（1））模板单、双双链DNA均可可。不能混混有蛋蛋白酶酶、核核酸酶酶、DNA聚合合酶抑抑制剂剂、DNA结合合蛋白白类。。一般100ngDNA模板板/100L。。模板浓浓度过过高会会导致致反应应的非非特异异性增增加。。3PCR反应应条件件（2））引物物浓度度0.1-0.5mol/L浓度过过高易易导致致模板板与引引物错错配,反应应特异异性下下降。。（3））TaqDNA聚合合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增增加使使反应应特异异性下下降;酶量量过少少影响响反应应产量量。（4））dNTPdNTP浓浓度取取决于于扩增增片段段的长长度四种dNTP浓浓度应应相等等浓度过过高易易产生生错误误碱基基的掺掺入,浓度度过低低则降降低反反应产产量dNTP可可与Mg2+结合,使游游离的的Mg2+浓度下下降,影响响DNA聚聚合酶酶的活活性。。（5））Mg2+Mg2+是DNA聚聚合酶酶的激激活剂剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应应体系系。Mg2+浓度过过低会会使Taq酶活活性丧丧失、、PCR产产量下下降；；Mg2+过高影影响反反应特特异性性。Mg2+可与负负离子子结合合,所所以反反应体体系中中dNTP、EDTA等等的浓浓度影影响反反应中中游离离的Mg2+浓度。。2）循循环参参数变性使双链链DNA解解链为为单链链94oC20-30秒(2)退退火温度由由引物物长度度和GC含含量决决定。。增加温温度能能减少少引物物与模模板的的非特特异性性结合合;降降低温温度可可增加加反应应的灵灵敏性性。（3））延伸伸70-75℃,一般般为72℃℃延伸时时间由由扩增增片段段长度度决定定（4））循环环次数数主要取取决于于模版版DNA的的浓度度一般为为25-35次次次数过过多：：扩增增效率率降低低错误掺掺入率率增加加经典循循环参参数（（500bp以以内））94℃℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever1）不对称称PCR目的：扩增增产生特异异长度的单链DNA。方法：采用用两种不同浓浓度的引物物。分别称为为限制性引引物和非限限制性引物物,其最佳佳比例一般般是0.01∶0.5μM,关键是限限制性引物物的绝对量量。用途：制备备核酸序列列测定的模模板制备杂交探探针基因组DNA结构功功能的研究究PCR的类类型高浓度引物物低浓度引物物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的的互补引物物来扩增两两引物以外外的DNA片段对某某个已知DNA片段段两侧的未未知序列进进行扩增。。可对未知序列扩增后进行行分析,如如探索邻接接已知DNA片段的的序列；用用于仅知部部分序列的的全长cDNA的克克隆,扩增增基因文库库的插入DNA；建建立基因组组步移文库库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）用于检测特特定基因序序列的存在在或缺失。。电泳引物123412344）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素素、荧光素素等对ＰＣＣＲ引物进进行标记,用以直观观地检测目目的基因。。特别适合大大量临床标标本的基因因诊断可同时检测测多种基因因成分病毒1病病毒2病病毒3病病毒4标记引物物ＰＣＲ观察PCR产产物5）ＲＴＴ－ＰＣＣＲ逆转录酶酶ＤＮＡ聚聚合酶mRNAcDNA杂化双链链PCR扩扩增基因mRNA蛋白质多多肽链6)荧光定量量PCR（real-timePCR)通过荧光光染料或或荧光标标记的特特异性的的探针,对PCR产物物进行标标记记跟踪,实时在在线监控控反应过过程,结结合相应应的软件件可以对对结果进进行分析析,计算算待测样样品的初初始模板板量。荧光定量量PCR仪光定量PCR仪仪是一种种带有激激发光源源和荧光光信号检检测系统统的PCR仪,通常配配有电脑脑系统及及相应的的分析软软件。荧光定量量实时PCR与普通PCR的比较实时在线线监控对样品扩扩增的整整个过程程进行实实时监控控,能够实时时地观察察到产物物的增加加,直观地看看到反应应的对数数期降低反应应的非特特异性使用引物物和荧光光探针同同时与模模板特异异性结合合,提高了PCR反应的特异性性增加定量量的精确确性全程监控控,准确的算算法进行行定量结果分析析更加快快捷方便便,无需跑跑胶全新4通通道实时时荧光定定量PCR仪普通梯度度PCR仪PCR技技术的应应用1)基基因克克隆重组DNA质粒DNA基因片段大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因基因工程程产品5’5’BamHIBamHIBamHIBamHIGTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG质粒DNA目的基因限制性核核酸内切切酶2)基因因检测A’内源性病病变基因因正常人A病人人A正常人病人人正常病人3）基因因鉴定女性男性Y引物PCR男性女女性性PCR技技术在食食品安全全检测中中的应用用方法步骤骤：1、运用用化学手手段对DNA提提取；2、设计计并合成成引物；；3、进行行PCR扩增；；4、克隆隆并筛选选鉴定PCR产产物；5、DNA序列列分析。。转基因食食品的检检测《大豆中中转基因因成份定定性PCR检测测方法》》《玉米中中转基因因成份定定性PCR检测测方法》》《油菜籽籽中转基基因成份份定性PCR检检测方法法》《烟草中中转基因因成份定定性PCR检测测方法》》《植物性性饲料中中转基因因成份定定性PCR检测测方法》》《马铃薯薯中转基基因成份份定性PCR检检测方法法》《棉花中中转基因因成份定定性PCR检测测方法》》原理：标记基因因的PCR检测测1.报告告基因GUS基基因荧光素酶酶(LUC)基基因胭脂碱合合成酶(NOS)基因因GFP基基因2.抗抗性基因因PCR技技术在微微生物学学中的应应用一.微微生物检检测1.常规规PCR检测在1992年Rahn等利用沙沙门氏菌菌的invA基因设计计了一对对引物,第一次次用PCR的方方法对沙沙门氏菌菌进行了了检测试试验。共共检测了了630株沙门门氏菌,约100多种种血清型型和21个菌属属的142株非非沙门氏氏菌。结结果显示示,有两两株没有有检测出出,检出出率为99.14%。。2.多重重PCRCortez等等（2006））用多重重PCR检测了了家鸡屠屠宰场不不同来源源样品中中的鼠伤伤寒沙门门氏菌、、肠炎沙沙门氏菌菌和其他他血清型型的沙门门氏菌。。其使用用了3对对引物,分别来来自沙门门氏菌的的invA,pefA和sefA基因。在在检测的的288份样样品中,鼠伤寒寒沙门氏氏菌和肠肠炎沙门门氏菌的的检出率率为62%,其其他血清清型的沙沙门氏菌菌为10%。3.巢式式PCR巢式PCR(nestingPCR)是指指先后用用两套引引物进行行扩增的的PCR技术术,用内内外两对对引物先先后扩增增靶基因因片段。。通常是是先用第第一套引引物扩增增15-30个循循环,再再用已扩扩增的DNA片片段内设设定的第第二套引引物扩增增15-30个循循环。由由于第二二套引物物设计片片段位于于第一套套引物扩扩增的片片段内,所以将将第一套套引物称称为外引引物,而而把第二二套引物物叫做内内引物。。巢式PCR既既可增加加反应的的物异性性,又可可得到丰丰产的特特异性靶靶序列,增加敏敏感性。。巢式PCR技技术对微微生物的的检测和和单拷贝贝基因靶靶DNA的扩增增都是非非常有效效。Hashimoto等（1995））基于编编码Vi抗体的的基因序序列改进进了巢式式PCR,所有有的伤寒寒菌(包包括丙型型副伤寒寒)都能能检出,灵敏敏度可以以达到单单个细胞胞水平。。Prakash（2005））的研究设计计了肠沙门氏氏菌Typhi血清型菌菌株的H12d特异引物对进进行巢式PCR,结果显显示,该巢式式PCR能够够代替Widal测试方方法诊断伤寒寒症。4.荧光定量量PCRNam等[10]建建立和评价价了SYBRGreen1实实时PCR特特异检测沙门门氏菌的方法法。用大小为为119bp的invA基因作作为检测靶点点,对124株沙门氏氏菌和116株非沙门氏氏菌进行了检检测。检测结结果显示,所所有的沙门氏氏菌有invA基因阳性性条带,而非非沙门氏菌均均没有扩增条条带。5.热起动动PCR热起动PCR(HotstartPCR)指的是使使TaqDNA聚合酶酶只在样品温温度超过至少少70℃时才才发挥作用的的PCR。它它是为提高反反应的特异性性设计的。如如所周知道,TaqDNA聚合酶酶通常在比适适宜温度低得得多的条件下下仍有较强的的活性,会导导致非靶序列列的扩增,影影响PCR反反应的特异性性。热起动可可减少非靶序序列的扩增,从而提高反反应的特异性性。Yang等（（2006））设计了12对引物进行行多重PCR,并使用了了热启动酶,检测腊样芽芽孢杆菌毒素素基因。该体体系成功的检检测出了与食食物中毒及与与食品相关的的162株菌菌中潜在的毒毒素。二.微生物分分类鉴定在酿造工业中中，对于保持持发酵持久度度的一致性和和全体产品质质量的一致性性来说，从非非酿酒酵母菌菌株中纯化酿酿酒酵母菌株株是必要的。。传统的基于于形态、生理理生化的检测测和分类鉴定定方法常常比比较耗时且结结论也不确定定和完全，特特别是难于从从表现型上区区分Saccharomyces属属的S.cerevisiae，，S.bayanus和和S.diastaticus，，因为这些酿酿酒酵母它们们属于同一个个属。Yamagishi等应用标标定FLO1的开放阅读框框架的PCR法来区分分酿酒酵母和和非酿酒酵母母，PCR分分子水平的的显示结果表表明了二者的的不同展望PCR技术术和以PCR技术为基基础的分子生生物学技术给给现代生物学学的研究带来来了革命性的的变化，微生生物学自然也也不例外，它它们给微生物物学的研究开开辟了一个新新的天地，微微生物由于个个体微小和本本身研究的特特殊性，相对对与其他学科科来说更需要要PCR技技术和以PCR技术为为基础的分子子生物学技术术。相信随着着科学技术的的进一步发展展及其在微生生物学应用领领域的扩大，，它们必将发发挥出更大的的作用。核酸分子杂交交技术SOUTHERNNORTHERN第一节节核酸分子杂交交的基本原理理原理：碱基互互补配对原则则一、核酸分子子杂交(nucleicacidhybridization)来源不同的两两条单链核酸酸分子通过碱碱基互补形成成异源双螺旋旋分子，称为为核酸分子杂交交。杂交可分成：：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间间的杂交。复性RNADNA待测核酸序列列探针(probe)：已知核酸序列列二、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因因素作用下，，DNA双链链解开成两条单链的的过程。方法：过量酸、碱、、加热、变性性试剂如尿素素、甲酰胺以及某某些有机溶剂剂如乙醇、丙丙酮等。变性后其它理理化性质变化化：OD260增增高 粘度度下降比旋度下降浮浮力密度度升高酸碱滴定曲线线改变 生物物活性丧失DNA变性的的本质是双链链间氢键的断断裂Tm：变性是在一个个相当窄的温温度范围内完完成，在这一一范围内，双双链DNA变变性一半所需需要的温度称称为DNA的的解链温度，，又称熔解温温度(meltingtemperature,Tm)。。其大小与G+C含量成正比。。计算公式Tm=（G+C）%×0.41+69.3三、DNA的的复性DNA复性(renaturation)的定定义在适当条件下下，变性DNA的两条互互补链可恢复天然的双双螺旋构象，，这一现象称称为复性。热变性的DNA经缓慢冷冷却后即可复复性，这一过程称为为退火(annealing)。减色效应DNA复性时时，其溶液OD260降低低。。DNA-DNA杂交交双双链链分分子子变性复性不同同来来源源的的DNA分分子子第二二节节核核酸酸分分子子杂杂交交的的基基本本方方法法核酸酸分分子子杂杂交交的的类类别别（一一））DNA印印迹迹技技术术(Southernblotting)用于于基因因组组DNA的的定定性性定定量量分分析析、、酶酶切切图图谱谱分分析析、、基基因因突突变变分分析析及及限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性分分析析（（RFLP））等等。。（二二））RNA印印迹迹技技术术(Northernblotting)用于于RNA的的定定性性定定量量分分析析。。蛋白白质质的的印印迹迹分分析析(Westernblotting)用于于蛋蛋白白质质定定性性定定量量及及相相互互作作用用研研究究。。其他他斑点点印印迹迹(dotblotting)原位位杂杂交交(insituhybridization)（一一））Southern印迹迹杂杂交交DNA印印迹迹E.Southern1975年年Southernblot步步骤骤（1））待测测核核酸酸样样品品的的制制备备：提提取取基基因因组组DNA，，并并用用适适当当的的限限制制性性内内切切酶酶消消化化水水解解基基因因组组DNA，，成成大大小小不不一一的的DNA片片段段。。（2））待测测DNA样样品品的的电电泳泳分分离离。。（3））凝胶胶中中核核酸酸的的变变性性：DNA在在制制备备与与电电泳泳过过程程中中DNA片片段段始始终终保保持持双双链链结结构构。。电电泳泳结结束束后后DNA变变性性并并转转移移到到适适当当的的固固定定支支持持物物上上才才能能进进行行Southernblot。。变性性通通常常用用碱碱变变性性法法。。（4））Southern转转膜膜：将将凝凝胶胶中中的的DNA进进行行碱碱变变性性并并将将PH恢恢复复中中性性后后，，即即可可将将凝凝胶胶中中DNA转转移移到到固固定定支支持持物物上上。。固定定支支持持物物：硝硝酸酸纤纤维维素素（（NC））膜膜、、尼尼龙龙膜膜、、化化学学活活化化膜膜和和滤滤纸纸等等。。转移移方方法法：毛毛吸吸管管虹虹吸吸印印迹迹法法、、电电转转印印迹迹法法、、真真空空转转移移法法。。（5））已已知知序序列列的的DNA探探针针的的制制备备（6））Southern杂杂交交：在在将将固固定定于于膜膜上上的的DNA片片段段与与探探针针进进行行杂杂交交前前，，必必须须先先进进行行一一个个预杂杂交交的过过程程。。因因为为能能够够结结合合DNA的的膜膜同同样样可可以以和和探探针针DNA结结合合，，在在进进行行杂杂交交实实验验前前，，必必须须将将膜膜上上所所有有能能与与DNA结结合合的的位位点点全全部部封封闭闭。。（7））杂交交结结果果的的检检测测：采采用用核核素素标标记记的的探探针针或或发发光光剂剂标标记记的的探探针针进进行行杂杂交交时时，，在在杂杂交交洗洗膜膜后后，，将将滤滤膜膜和和X线线片片装装入入暗暗盒盒，，感感光光后后，，经经冲冲洗洗，，在在X线线片片上上可可见见黑黑色色条条带带。。方法法1.酶酶解解DNA限制制性性内内切切酶酶（（RestrictionEnzyme,RE）限制制性性片片段段长长度度多多态态性性（（restrictionfragmentlengthpolymorphism，，RFLP）2.分分离离电泳泳在电电场场中中带带电电粒粒子子向向带带符符号号相相反反的的电电极极移移动动的的现现象象称称为为电泳泳（electrophoresis））。3.凝凝胶胶中核核酸的的变性性碱变性性中和处处理4.转转膜膜硝酸纤纤维素素膜尼龙膜膜转膜方方法毛细管管虹吸吸印迹迹法电转印印法真空转转移法法毛细管管虹吸吸印迹迹法电转印印法真空转转移法法5.杂杂交交预杂交交：封闭非非特异异性DNA位点点。杂交6.杂杂交交结果果的检检测放射自自显影影照片片（二））Northernblot和Southernblot不不同在在于：：A：靶靶核酸酸是RNA；B：RNA电泳泳时，，凝胶胶中加加入变变性剂剂，防防止RNA分子子形成成二级级结构构；C：电电泳结结束后后直接接转膜膜。一、原原理三种印印迹技技术的的比较较第三三节节探探针针探针(probe)一小段段用同同位素素、生生物素素或荧荧光染染料等等标记记其末末端或或全链链的已已知序序列的的多聚聚核苷苷酸，，与固固定在在NC膜上上的核核苷酸酸结合合，判判断是是否有有同源源的核核酸分分子存存在。。一、核核酸探探针的的来源源基因组组DNA探探针cDNA探探针RNA探针针寡核苷苷酸探探针二、核核酸探探针的的标记记物•①高度度灵敏敏性；；②标记记物与与核酸酸探针针结合合，应应绝对对不能能影响响核酸酸探针针与模模板的的结合合能力力及结结合的的特异异性；；③当用用酶促促方法法进行行标记记时，，应对对酶促促活性性（Km值值）无无多大大影响响，以以保证证标记记反应应的效效率和和标记记产物物的比比活性性；④高度度特异异性；；⑤较高高的化化学稳稳定性性，保保存时时间长长，标标记及及检测测方法法简单单；⑥对环环境无无污染染，对对人体体无损损伤；；⑦价格格低廉廉等。。常用的的探针针标记记物：：放射性性同位位素：：3H、32P、35S、125I等。。非放射射性同同位素素：荧光、、地高高辛素素、辣辣根过过氧化化酶、、碱性性磷酸酸酶等等。放射性性核素素标记记物（灵敏度度极高高）①32P：释释放ββ-粒粒子,能量量高,穿透透力极极强。。②35S：35S的放放射性性亦较较强，，但ββ-粒粒子能能量较较低，，因此此其检检测灵灵敏度度较32