基因工程第八章基因工程

第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆克隆（clone）无性繁殖应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。基因克隆示意图基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

1993

基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%科学家公布人类基因组工作草图公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用transformation

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径基因工程工具酶载体重组DNA技术的基本过程真核细胞转染克隆基因的表达工具酶酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的的工具具酶：：一把特特殊的的剪刀刀——限制性性内切切酶的的发现现阿尔伯伯(Arber)、史密密斯(Smith)和内森森斯(Nathans)，获1978年年诺贝贝尔生生理学学和医医学奖奖1953年年，Arber研究究噬菌菌体与与细菌菌（A、B）的的关系系。发现100-200个子子代噬噬菌体体中，，只有有1个个可感感染B，即即其他他的噬噬菌体体在B中受受到限限制，，唯有有这一一个受受到修修饰（（甲基基化））后感感染成成功。。细菌B：在在缺甲甲硫氨氨酸的的培养养基中中，细细菌死死亡。。原因：：细菌菌无法法对自自己的的DNA进进行修修饰。。假设：：限制制性内内切酶酶与修修饰酶酶。1967年年，Smith，分分析限制性性内切酶的的识别和切切割序列，，认为它由由5-6个个碱基组成成原因：限制制性酶将T7DNA切成成平均长度度为1000碱基的的片段。识别和切割割序列：中中心对称的的回文结构构。限制性酶：：HindⅡNathans：用用限制性酶酶切割猴子子SV40DNA，DNA测序序。限制性核酸酸内切酶(restrictionenzyme)识别双链DNA内部部特异位点点并裂解磷磷酸二酯键键分类：Ⅰ型型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：：发现次序序)识别和切割割位点回文结构4～～6bp出现两种末末端粘性末端粘端平头末端平端同工异源酶酶：来源不同，，但能识别别和切割同同一位点同尾酶：识别序列不不同，但产产生相同的的粘性末端端粘性末端与与平头末端端修饰酶DNA聚合合酶Ⅰ逆转录酶(reversetranscriptase)T4DNA连接接酶(T4ligase)碱性磷酸酶酶(alkalinephosphatase)末端脱氧核核苷酰转移移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合合酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠⅠ)的活活性5′至3′′的聚合活活性5′→3′方向核酸外切切酶活性5′→3′外切酶酶活性3′→5′外切酶酶活性polⅠⅠ经枯草杆杆菌蛋白酶酶裂解可得得大、小两两个片段大片段（（Klenow片段）：聚合活活性、3′→5′外切活活性常用的工具具酶核酸外切酶酶活性3′→5′′外切酶活活性5′→3′′外切酶活活性末端脱氧核核苷酰转移移酶(TDT)载体vectorDNA，，能在宿主主细胞中进进行自我复复制和表达达克隆载体、、表达载体体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬噬菌体体（λ，M13）等等真核载体：动物病毒毒载体pLXSN等等常用的克隆隆载体质粒(plasmid)—存在于细细菌染色体体外的小型型环状双链链DNA分分子理想的质粒粒拷贝数多;两三个遗传传标志，如如抗药性基基因：抗氨苄青霉霉素基因(ampr)、抗四环素基基因(terr)；β-半乳糖苷酶酶基因(lacZ)筛选标志多个限制酶酶的单一切切点，即多克隆位点点(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆隆载体λ噬菌体(λphage)基因组分三三个区域：：左侧区、、中间区（非必需区区）、右侧侧区DNA，替替换型载体体，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系系列、λλgt系系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：：λDNA的cos区+质粒，双双链环状DNA，克克隆容量：：40~50kbM13噬菌菌体最大优点：：产生单链链DNAcos:cohesive-endsite特点点：：RFDNA:replicationalformDNA优点点：：表达达载载体体(expressingvector)特点点：：带带表表达达构构件件——转转录录和和翻翻译译所所需需的的DNA序序列列大肠肠杆杆菌菌表表达达载载体体：：含含启启动动子子——核核糖糖体体结结合合位位点点——克克隆隆位位点点——转转录录终终止止信信号号启动子子：trp-lac(tac)启启动子子、λλ噬菌菌体PL启动子子、T7噬噬菌体体启动动子核糖体体结合合位点点(ribosome-bindingsite,RBS)：：起始始密码码子(ATG)和SD序序列转录终终止序序列哺乳动动物表表达载载体真核表表达元元件：：启动动子/增强强子——克隆隆位点点—终终止信信号和和加poly(A)信号号重组DNA技术的基基本过程目的基因因的制备备载体的选选择和制制备DNA分分子的体体外连接接将外源DNA导导入宿主主细胞目的基因因的筛选选和鉴定定目的基因因(targetDNA)的制备目的基因因（外源源基因））制备基因因组DNA基因文库库(genomiclibrary)—存在于于转化细细菌中、、克隆载载体携带带的所有有基因组组DNA的集合合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于于表达的的基因片片段：PCR技技术、化化学合成成载体的选选择和制制备：λ噬菌体体、粘性性质粒、、pUC系列列、M13噬菌菌体DNA分分子的体体外连接接（DNA连接接酶）粘性末端端连接连接效率率高相同酶切切末端平端连接接连接效率率低人工接头头(linker)法法同聚物接接尾法同聚物接接尾法将外源DNA导导入宿主主细胞基因工程程菌HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细细胞冷的氯化化钙处理理，细胞胞处于最最适摄取取和容忍忍外来DNA的的生理状状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌菌体和细胞病病毒介导的遗遗传信息转移移过程转染(transfection)：真核细胞胞主动摄取或或被动导入外外源DNA片片段而获得新新的表型的过过程。目的基因的筛筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选选择标志补救表达产物与营营养缺陷互补补α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交PCR限制性酶切图图谱IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ββ-D-半乳乳糖苷)bp—1534—994—695—515—377—237ABCM克隆基因的表表达载体有转录、、翻译的元件件；密码子子通用原核表达体系系原核表达载体体的标准合适适的的筛筛选选标标志志强启启动动子子翻译译控控制制序序列列多克克隆隆位位点点融合合蛋蛋白白（（fusionprotein,包包涵涵体体））表达达的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽的的N末末端端由由原原核核DNA编编码码，，C末末断断由由克克隆隆的的真真核核DNA编编目目。。大肠肠杆杆菌菌表表达达体体系系的的不不足足缺乏乏转转录录后后加加工工机机制制，，只只能能表表达达cDNA缺乏乏翻翻译译后后加加工工机机制制，，不不能能折折叠叠和和糖糖基基化化融合合蛋蛋白白形形成成包包涵涵体体，，复复性性后后才才有有活活性性很难难表表达达大大量量的的可可溶溶性性蛋蛋白白真核核表表达达体体系系转染染方方法法磷酸钙钙沉淀淀DEAE葡葡聚糖糖介导导转染染电穿孔孔脂质体体转染染；人人造膜膜显微注注射筛选标标志tk-NeorG418瞬时转转染目的基基因不不整合合进宿宿主基基因组组稳定转转染目的基基因整整合进进宿主主基因因组tk-细胞突突变株株筛选选转染染细胞胞胸苷激激酶（（tk）TTP：从从头合合成（（氨甲甲喋呤呤阻断断），，补救救合成成HAT选择择（H：次次黄嘌嘌呤；；A：：氨甲甲喋呤呤；T：胸胸苷））tk+：生长长tk-+带tk基基