基因操作原理02

第二章

分子克隆工具酶

切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质任何物种都有排除异物保护自身的防御机制

免疫系统

细菌的限制与修饰系统限制性内切酶

修饰酶第一节

限制性内切酶Restrictionendonuclease一、限制与修饰Restrictionandmodification50年代初，发现

hostcontrolledspecificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。1.现象EOPEfficiencyofplatepfuplaqueformingunitE.coliKE.coliCEOP=1EOP=1EOP=1EOP=10-4E.coliKE.coliBE.coliCKBCE.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤

C5‘甲基-胞嘧啶2.限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年

首次从E.coliK中分离限制性内切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点远离识别位点1000bp以上1970年

美国约翰·霍布金斯大学

H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA无细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA

即HindII酶5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYR5’...GAATTC...3’3’…CTTAAG...5’EcoRI3.限制酶的命名宿主

属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号序号

罗马字HindIIEcoRI

早前加R,orM菌株号和序号小写1986年下半年

615R98M1998年

10000细菌

古细菌

3000种酶

200多特异性RestrictionEnzymes3529TypeI49TypeII3470TypeIII10Methyl-Directed4Enzymes:

RestrictionEnzymes3601

TypeI51

TypeII3540

TypeIII10

Methyl-Directed4

WeirdoREs1

PutativeREs631

Methylases696

TypeI45

TypeII550

TypeIII12

OrphanMethylases89

WeirdoMethylases0

PutativeMethylases900

OtherKindsofEnzymes:

HomingEndonucleases62

NickingEnzymes22

ControlProteins33

SpecificitySubunits592003CommercialAvailability:RestrictionEnzymes:583568Methylases:1817HomingEndonucleases:65NickingEnzymes:78DistinctTypeIIREspecificities:207213200220033.限制与修饰系统的种类

亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子分三类(I,II,III)也有分四类，IIs类，即II亚类(1)typeII93%识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割

3’-OH,5’-P，需Mg2+，相应的修饰酶需onlySAM识别序列主要为4-6bp，

或更长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列

切割位置因酶而异，有些是隔开的R:一般为同源二聚体,反向结合

作用在两条链M:单体

DNA同时切割,M只作用新链typeIIs占5%

识别位点非对称,非间断

4-7bp切割位点可能在20bp范围内。R:与

typeII具有相同的辅助因子要求M:通常由两个M来完成,各作用一条链(2)typeI和

typeIIItypeI(1%)种类少

如

EcoREcoBR酶和M酶

各作为一个亚基存在于酶分子中

即R基和M亚基，

还有负责识别DNA序列的S亚基

分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码

属于同一操纵子（转录单位）EcoKR2M2S

EcoBR2M4S2P1—hsdR—P2—hsdM—hsdSM-M-R-M-R-M+突变

M+S-R-M-GenetypephenotypeM-R-M-保全机制识别位点EcoBTGA*(N)8TGCT

A*EcoKAAC(N6)GTGCA*甲基化位点

°可能的甲基化位点切割位点1000bp以外,无特异性°°typeIII(<1%)EcoP1EcoP15识别

AGACCCAGCAG切割

下游

24-26bp处(3)I-prefix和

PI-prefix是否为R/M系统中的一个成员?DNA前RNAmRNAIntronmRNA蛋白活性蛋白Inteins前提蛋白mRNA蛋白活性蛋白Inteins前提蛋白IntronInteins相对性I-CeuI

衣滴虫(Chlamydomonaseugametos)(unicellulargreenalga)叶绿体大rRNA基因的内含子TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA37℃26bp识别位于19bp核心上

-12--+7TAACGGTCCTAAGGTAGCGPI-PspI极端嗜热菌PyrococcusspeciesGB-D嗜热DNA聚合酶内切酶是蛋白质体内拼接的产物，在同一个多肽前体上同时产生聚合酶和该内切酶活性TGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT65℃30bpThesequencedegeneracytoleratedbythisenzymehasnotyetbeendetermined其它

I-PpoIPI-TliIPI-SceI(VDE)线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体Enzymes:

RestrictionEnzymes3601

TypeI51

TypeII3540

TypeIII10

Methyl-Directed4

WeirdoREs1

PutativeREs631

Methylases696

TypeI45

TypeII550

TypeIII12

OrphanMethylases89

WeirdoMethylases0

PutativeMethylases900

OtherKindsofEnzymes:

HomingEndonucleases62

NickingEnzymes22

ControlProteins33

SpecificitySubunits592003CommercialAvailability:RestrictionEnzymes:583568Methylases:1817HomingEndonucleases:65NickingEnzymes:78DistinctTypeIIREspecificities:20721320022003HomingendonucleasesaredoublestrandedDNasesthathavelarge,asymmetricrecognitionsites(12-40basepairs)andcodingsequencesthatareusuallyembeddedineitherintronsorinteins.IntronsaresplicedoutofprecursorRNAs,whileinteinsaresplicedoutofprecursorproteins.Homingendonucleasesarenamedusingconventionssimilartothoseofrestrictionendonucleaseswithintron-encodedendonucleasescontainingtheprefix,"I-"andinteinendonucleasescontainingtheprefix,"PI-".Homingendonucleaserecognitionsitesareextremelyrare.

Forexample,an18basepairrecognitionsequencewilloccuronlyonceinevery7x10llbasepairsofrandomsequence.Thisisequivalenttoonlyonesitein20mammalian-sizedgenomes.However,unlikestandardrestrictionendonucleases,homingendonucleasestoleratesomesequencedegeneracywithintheirrecognitionsequence.Asaresult,theirobservedsequencespecificityistypicallyintherangeof10-12basepairs.5′...GAGTCNNNN^N...3′

3′...CTCAGNNNNN...5′

N.BstNBIcatalyzesasingle-strandnickonthe3′sideoftherecognitionsequence.N.BstNBIisasitespecificendonucleasethatcleavesonlyonestrandoftheDNAonadoublestrandedDNAsubstrate.Thenickingendonucleasecatalysesasingle-strandbreak4basesbeyondthe3′sideoftherecognitionsequence,GAGTCNNNN/.二、限制性内切酶识别的序列4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorT

NciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTC

HindIIIAAGCTT1．长度

4、

5、

6>6NotIGCGGCCGC8BbvCICCTCAGC7PpuMIRGGWCCY7R=AorGY=CorTM=AorCK=GorTS=CorGW=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT4Nt=44=2566Nt=46=4096①

回文对称

468572.结构EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA②

非对称AccBSICCGCTC(-3/-3)BssSICTCGTG2.结构Numbersinparenthesesindicatepointofcleavagefornon-palindromicenzymes③

多识别序列

(简并序列)AccIGTMKACHindIIGTYRAC④

间断对称AlwNICAGNNNCTGDdeICTNAG3．切割位置

①

内部

大多数AccBSICCGCTC(-3/-3)GGCGAG-2/-4

②

两端

EcoRIICCWGGSau3AIGATCNlaIIICATG

③

两侧

BcgI(10/12)CGA(N)6TGC(12/10)10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6ACG(N)10TspRICASTGNN/NNCAC(G)TGNNNNGTG(C)ACNN

④

单侧

BbvIGCAGC(8/12)BspMIACCTGC(N4)TGGACG(N8)4.特殊系列

I-prefix&pI-prefix三、限制性内切酶产生的末端Cohesiveterminus(end)1.匹配粘端(粘性末端）末端相同①

在对称轴5’侧切割底物DNA双链交错断开→5’protrudingEcoRI…NNGAATTCNN……NNCTTAAGNN……NNGAATTCNN……NNCTTAAGNN…②3’-侧→3’突出末端

5‘recessedKpnI

GGTACC

CCATGG

2.平端

Bluntend在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC3.非对称突出端

①

来自非对称识别序列

CCTCAGCBbvCI

GGAGTCG

②

简并序列

AccI

GT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC

③

间隔序列

DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG4.同裂酶(isoschizomer)识别相同序列的限制酶称同裂酶①

同序同切

HindIIHincII

GTY/RAC

HpaIIHapII

C/CGG

MobISau3AI

/GATC同功酶？②

同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC③

“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC④

其它

SalI

G/TCGAC

AccI

GT/MKAC

HincII

GTY/RAC5.同尾酶平端同裂酶5.同尾酶平端同裂酶BamHIGGATCC

Sau3AIGATC

ClaIATCGATAccIGTMKACpUC19BstBITTCGAATaqITCGA四、末端长度对切割的影响双酶切

PCR产物1.Labeled寡核苷酸

20UnitsRE1ugoligo2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTCC>90>90

PstI

GCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)14

>90>90

CTGCAG(N)20002.DNA片段（线性载体）

10/ugDNA60minCGTACG

CTCGAG

GAATTC

CTGCAG

GATATCpLITMUS28/29...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1baseEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIXhoI:

1EcoRI100%PstI:1EcoRI88%在双酶切多克隆位点时，选酶切秩序在设计引物引入酶切位点时,应在位点之外引入所要求的碱基数,由于未计算单链部分的4个碱基，因此应在末端另加4个。NNNNNNNN-3’AAGCTTNNNNNNNN-3’HindIIIHindIII3bp90%NcoI2bp91%NcoI1bp0BamHINNAAGCTTNNNNNNNN-3’HindIIIHindIII3bp90%NcoI2bp91%NcoI1bp0BamHINNNNNNAAGCTTNNNNNNNN-3’HindIIIHindIII3bp90%NcoI2bp91%NcoI1bp0BamHI五、位点偏爱

(sitepreferences)单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA完全消化所需的酶量NEBin50l体系/Pharmacia50lDNA某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割*1975EcoRI切割

phage(Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。*1976EcoRI在腺病毒2(adenovirus-2)DNA中的切割速率不同。1.现象*

有4个

SacII位点

三个在中央

一个在右臂（Right-terminus）

at40,386

中央三个快50倍*1981EcoRI和HindIII在中的切割速率

分别有10倍和14倍的差异

（=48502bp12bp粘端）*1977，X174ssDNA5386bpcircle

HgaI切割某些位点比其它的快*1983腺病毒2中，CTCGAG位点对PaeR7I完全抵抗

但同裂酶XhoI,却很易切割，原因是5’末端有一个CT二核苷酸

与甲基化完全无关NEB检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍的范围上，但有许多酶有较大的差异,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG(1)pBR322含4个NarI位点1单位酶

1hr(标准条件)将两个位点完全切割但是另外两个位点50单位,16小时

不能完全切割完全(2)NaeI在pBR322也有4个位点，其中两个易切割，有一个有点慢,第四个慢50倍。在

DNA上NarI和NaeI各都有一个位点，但是过量的酶只能完成部分酶切。酶单位定义通过切割腺病毒2DNA来测定的A-virus2有至少10个位点1单位NaeIorNarI是切割1g腺病毒2DNA在50l体系中1hr完全所需的酶量2.原因(1)

在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用(2)

BspMI、EcoRII、HpaII对它们作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点(allosteric)由顺式方式提供（cis）

它们相互靠近或可形成环（loop）由反式方式提供（trans）

其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供BspMI难以切割DNA在pBR322和pUC18/19中有一个BspMI位点100倍的过量切割时/一半DNA未切割ACCTGC(4/8)3．酶量使用差异cccDNA,linearDNA单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA完全消化所需的酶量1Unit/1gDNA少数少

AseI0.3Ufor1gpBR322多数多

pUC19AvaI10u,NarI20U,ScaI15U

EagI10UforpBR322&LITMUSSacIEagI在不切割DNA时改变DNA的构象plasmidPlasmid/SalIPlasmid/EagIEagIEagISalISalISphISphI二聚体

单体

?六、酶切反应条件任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件(一)缓冲液1.常规缓冲液pH,Mg++,DTT,BSA(10X)①pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl,乙酸②

离子强度：

NaCl高

中

低

100mM50mM0③Mg++10mMMgCl2,MgAc④DTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)1mM⑤100g/mlBSA少数需要⑥

乙酸盐缓冲液⑦

其它特用缓冲液，如NEB的U体系

不同酶具有不同Buffer

各公司设立几种常用BufferNEBuffer1NEBuffer2NEBuffer3NEBuffer4BufferABufferBBufferHBufferLRoche2.通用缓冲体系

PhamaciaOne-Phor-Allbufferplus,OPA+

谷氨酸钾缓冲液（KGB）Potassiumglutamatebuffer使用浓度不同

0.511.522：50-80%,3：正常相当于厂家的活性

4：高于厂家提供的活性3.双酶切策略

a.选用都合适的BufferorKGBb.不可替代：先低，加适量NaCl和第二种酶

c.先低后高（可纯化或不纯化）4.注意事项a.取少量酶

(方法

or稀释

)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.分装（对于多个反应）(二)反应温度大多数为37℃一部分为50-65℃

少数25-30℃高温作用酶于37℃时活性多数10-50%TaqI(65℃)10%,ApoI(50℃)50%SmaI(25℃)37℃halflife15min(三)反应时间

1hrormore许多酶延长其反应时间可减少酶的用量

16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)(四)反应终止1.EDTA终10mM2.加热

37℃

酶

65℃20minotherwise80℃20min不失活在80℃20min的酶37℃：Bg1IIHpaIPvuII65℃：Tth111ITspRI50℃：Bc1I3.其它

DNA纯化(苯酚,试剂盒)七、星星活性(staractivity)

非特异性切割在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性1.概念

实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI2.酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关最普遍的活性变化1个碱基的变化识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口EcoRI的研究表明

pH的升高和离子强度的降低

可切割N/AATTN

切割只有一个碱基不同的序列

(但这个变化的碱基在中央序列

AATT中不是A到T或T至A的变化)3.引起星星活性的因素①

高浓度甘油（>5%）②

酶过量（>100U/g）③

低离子强度（<25mM）④

高pH(>pH8.0)⑤

有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane⑥

用其它二价阳离子代替Mg++Mn++，Cu++，Co++,Zn++不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感星星活性在绝大多数情况下，是可控制的4.抑制星星活性的条件（措施）①

减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度②

保证反应体系中无有机溶济或乙醇③

提高离子强度到100～150mM(如果不会抑制的话)④

降低反应pH至pH7.0⑤

使用Mg++作为二价阳离子X174(5386bases)

M13mp18(7249bases)Wildtype6407base八、单链DNA的切割Cleavageofsingle-strandedDNAHinP1I,HhaI,MnlIat50%oftherateofdsDNAHaeIII10%BstNI,DdeI,HgaI,HinfI,TaqI100倍慢不切割：AluI,BbvI,DpnI,FnuDII,FokI,HpaII,HphI,MobI,MobII,MspI,Sau3AI,SfaNI1.外因反应条件底物的纯度(杂质,污染-盐-酚)九、影响活性的因素2.“内因”①sitepreferences②甲基化③底物的构象/位点切割cccDNA和linearDNA时表现的差异EcoRIPstISalI需要至少5倍的酶PaeR7I与XhoI同功同切，但如果5‘端为CT则PaeR7I不能切割十、酶切位点的引入

（酶切水平）1.产生的5’突出端补平后连接EcoRIGAATTCCTTAAG...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstI...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstI...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA

AseIXmnIHindIIIAAGCTAGCTT

TTCGATCGAA

AluINheI2.同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)

AlwI(GGATC4/5)3.平端连接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)

MobI(GATC)十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性GC%酶切位点出现的机率BamHIGGATCCEcoRIGAATTC在基因组中，碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb·细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少·酵母基因组G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的识别序列就特别少哺乳动物细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的第二章

工具酶

第一节

限制性内切酶一、限制与修饰二、限制性内切酶识别的序列三、限制性内切酶产生的末端四、末端长度对切割的影响五、位点偏爱

(sitepreferences)七、星星活性(staractivity)六、酶切反应条件八、单链DNA的切割第二节

甲基化酶

MethylaseMethylation methyltransferase一、甲基化酶的种类在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶1.Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基PvuIIBamHIBclIBglIIXhoII

MboISau3AI

识别位点中含GATC序列

ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)

MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列有些限制酶对Dam甲基化敏感不能切割相应的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-

E.coli中提取DNA2.Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基EcoRII/BstNI

CCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响BstNI可避免这一影响受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等不受影响酶有：KpnI

GGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等3.EcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGCTTG(N)6CACGAN6位置但识别位点少(1/8kb)研究较少而dam（1/256bp）

dcm(1/512bp)4.SssI甲基化酶来自原核生物SpiroplasmaCG序列中的C在C5位置上甲基化可在未甲基化或半甲基化链上起作用许多酶对此甲基化敏感AatIIClaIXhoISalI等不敏感的有BamHIEcoRISphIKpnISssI甲基化的DNA受E.coliMcrA,McrBC,Mrr系统的限制5.其它甲基化酶二、依赖于甲基化的限制系统

E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列依赖于甲基化的内切酶mcrA,mcrBC,mrr

都限制由

CG甲基化酶(MSssI)作用的DNAMrr也限制m6AMcrBC切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔3kb，最适为55～103bp，需GTP大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统三个都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修饰的位点McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点三、甲基化对限制酶切的影响1.修饰酶切位点①HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAACM.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割②

BamHIGGATCC

M.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割③构建DNA文库时用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因组DNA用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCT

TaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*

*AGCT*AGCTDpnI3.用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG肠道细胞的Gm6ATCCm5/4CGGMspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATCSau3AI可切割，MobI不可切割其它4.对基因组作图的影响在哺乳动物DNACpG序列出现的频率大约只有预计的1/5

含CpG序列的识别序列极其稀少大多数CpG都发生甲基化

含CpG的所有识别序列的酶不能切割CpG甲基化大多数不完全

对酶切位点稀少的酶来说

在其识别位点上的甲基化具可变性第三节

DNA聚合酶DNApolymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性

真核细胞有

4种

DNApoly：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出大是出，与细胞增生无关。：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I．单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶一、大肠杆菌DNA聚合酶

IEcoliDNApolymeraseI1.活性单链多肽(109kDa)

三种活性①5’→3’DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（带3‘OH基）

或

5’突出DsDNAMg2+dNTPDNApolyI②5’→3’外切核酸酶活性底物:dsDNAorDNA:RNA杂交体活性：从5’端降解dsDNA，也降解

RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性)Mg2+

DNApolyI+dNTP③3’→5’外切酶活性底物：3’-OHdsDNAorssDNA活性：从3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封闭。Mg2+

DNApolyI+dNTPMg2+

DNApolyI+dNTPProofreading反应平衡过量dNTP平端2.用途①切口平移法标记DNANicktranslation（所有DNApoly中只有此有此活性）Mg2+,低限量DNaseIdNTPDNApolyI产生切口切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移若有放射性dNTP,则可标记成探针②用于cDNA克隆中的第二链即单纯的DNA聚合活性但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶③末端标记（交换或置换反应）Mg2+,DNApolyI[-P32]dATPA*TT4DNApolyT7DNApoly更好二、Klenow酶E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响，或基因工程而得76kDa1.活性共两种,同DNApolyI2.作用①补平3’凹端，注意要用dNTP②抹平3’凸端，注意必须加足量dNTPT4和T7具更强3’--5’外切活性，被取代③末端标记

A．置换反应同前,同样被T4poly代替

B．补平3’--凹端的过程进行标记④cDNA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。⑦PCR反应被Taq等取代⑧在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA仅利用DNA合成活性三、T4噬菌体DNA聚合酶T4DNApolymerase来源于T4phage感染的E.coli

114kDa1.活性与Klenow酶相似但3’—5’外切活性强200倍不从单链DNA模板上置换引物因此在诱变反应中更有用2.用途①补平或标记3’

凹端必须有高浓度dNTP（末端标记）②置换反应必须有高浓度dNTP(一种)末端标记③标记DNA片段即利用外切活性产生了3’凹端再补平（用标记的dNTP）与切口平移相比有两大优点：

不产生发夹结构

经限制酶切割后易变成链特异性探针缺点：标记不均匀，且3’→5’外切活性强且快，当外切至中点时必须终止，否则变成二单链，而被降解④将dsDNA变成平端，需高浓度dNTP⑤定点诱变在ssDNA→dsDNA过程中由于T4不置换引物，效率提高1倍。四、T7噬菌体DNA聚合酶T7DNApolymerase来源于T7phage感染的E.coli为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白)T7DNApoly为持续合成能力最强的一个平均长度要大得多,在测序时具有优势活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似但3’→5’外切活性长Klenow的1000倍用途:A.替代T4的功能B.长模板的引物延伸修饰的T7DNApolymerase99%3’—5’外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于测序反应（测序酶）SequenaseUSBBiochemical五、耐热DNA聚合酶简略，详见PCRTaq,Vent,Pfu,Pwo,Tth等六、反转录酶Reversetranscriptase依赖于RNA的DNA聚合酶1．种类来自AMV禽成髓细胞瘤病毒Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒5’→3’合成DNA无3’→5’外切活性①AMV

二链多肽(62kDa/94kDa)具5’→3’DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争反应终止时，RNaseH可在正在增长的

DNA链近3’端切割模板趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度但在42℃(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA

早期提纯过程中易被内切酶污染,cDNA不超过1kb,现已解决②M-MuLV

单肽84kDaRNaseH活性弱利于合成较长cDNA纯度高工程产品42℃失活2．用途①cDNA克隆②测转录起始点（引物延伸法）③5’突出DNA的补平④测序反应(当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时)⑤其它RT-PCRRNA二级结构3.活性①5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNAorDNA模板及带3’OH的RNA或DNA引物②RNaseH活性RNaseH-突变4.注意事项

①无3’→5’外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。②为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。③单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低）,50g/ml放线菌毒D，抑制第二链合成。七、末端转移酶来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端T,C→首选Co2+A,G→首选Mg2+Terminaltransferase1.底物DNA,可短至3个核苷酸,3’突出低离子强度时,平端或3’凹出端DNA亦可但效率低2.用途①在3’端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记②末端标记ddNTP(标记的)37℃15min随时间的延长尾亦长。3.同尾的长度第四节

RNA聚合酶RNApolymerase来源于噬菌体感染宿主后所产生SP6噬菌体聚合酶来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株T3或T7噬菌体聚合酶来源于感染的大肠杆菌1.活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物，但识别特异性位点2.用途①体外：将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物②体内：用于表达外源基因A.Ecoli先构建宿主菌，将T7polyRNA基因置于lacUV5启动子之下，插入到噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶原菌EcoliBL21(DE3)：lacUV5启动子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌体DE3区，该区整合于染色体的BL21处。若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中在IPTG(异丙基硫代--D-半乳糖苷)诱导启动外源基因的表达另一种方法是，先导入重组质粒，再用（带T7RNApoly）感染，激活目的基因的表达B．酵母菌酵母启动子+T7RNApolyin稳定载体T7启动+外源基因in另一载体第五节

连结酶(Ligase)将两段核酸连接起来的酶1.T4DNAligase

68kDaT4噬菌体感染大肠杆菌产生催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二脂键

底物：DNAorRNA(效率低)

粘端，切口，平端

影响因素：

PEG（低浓度）10%

单价阳离子（150-200mMNaCl）

提高平端连接速率Weiss单位在37℃下20min催化1nmol

32p从焦磷酸根置换到[,

-32P]ATP所需的酶量。NEB单位(NewEnglandBiolabs)20l,16℃,30min,300g/ml(0.12M5’末端)/HindIII连接50%所需的酶量/HindIII(7个切点)23.1(kb)2.32.0564(bp)125

48502bp

1Weiss=67粘端连接单位

(NEB单位)

(Molecularcloning写为60NEBunit)

1NEB单位=0.015Weiss单位

条件

16℃～4hr4℃overnight

需ATP5min连接T4DNAligaseRoomtemperature(BoehringerMeinnham公司)2.E.coliDNA

连接酶与T4DNAligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆（不将RNA连接到DNA,不连接RNA）