基因文库技术

Leptin基因Micewithouttheleptingenearemorbidlyobese(right)comparedtonormalmice(left).

1994年，美国Rockfeller大学研究开发的肥胖相关基因Leptin以2000万美元转让给Amgen公司。

Effectsofrecombinanthumanleptintreatmentinachildwithleptindeficiency.第四章

目的基因的分离克隆

第一节

基因文库技术分离目的基因

1基因文库的含义

文库（library）：是指一种全体的集合。基因文库（genelibrary）：是指某一生物全部基因的集合。某生物基因组DNA片段(例如10n个)与载体分子重组，重组DNA转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上长出的单个菌落（或噬菌斑）即为一个DNA片段的克隆。全部片段克隆的集合即为该生物的基因文库。噬菌斑菌落2基因文库的分类

1）基因组文库和cDNA文库

基因组文库（genomicDNAlibrary）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。cDNA文库（cDNAlibrary）：是指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。2）克隆文库和表达文库

克隆文库由克隆载体构建。表达文库由表达克隆载体构建。3）不同载体的文库

（1）质粒文库（2）噬菌体文库（3）粘粒文库（4）人工染色体文库4）减法文库减法文库又称扣除文库及精简文库。它是通过野生型DNA与缺失型DNA，或不同时空、不同环境条件的两种cDNA样品反复杂交，去除杂交体后,将剩余的DNA或cDNA片段进行克隆而构建的文库。5）亚克隆文库亚克隆文库是将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法(shotgun)随机小片段化，然后用这些随机小片段建立的DNA文库。3基因文库的构建

1）基因组文库构建的基本步骤（1）基因组DNA的提取及片段化（2）载体的选择和制备（3）DNA片段与载体连接形成重组DNA（4）重组DNA转化宿主细胞基因组文库（genomicDNAlibrary）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。cDNA文库（cDNAlibrary）：是指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。基因文库（genelibrary）：是指某一生物全部基因的集合。噬菌斑菌落cDNA（complementaryDNA，互补DNA）：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的DNA。2）cDNA文库构建的基本步骤（1）细胞总RNA的提取并分离纯化出mRNA（2）合成cDNA的第一条链（3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA（4）双链cDNA与载体连接形成重组DNA（5）重组DNA转化宿主细胞5基因文库的筛选

1）核酸杂交法复性DNA核酸分子杂交的原理：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链。探针(probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在硝酸纤维素膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

探针的设计2）免疫学检测法免疫学检测法使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。抗体探针只适用于表达文库的筛选，并只能筛选出表达了的克隆。3）PCR筛选法1基因文库的含义是什么？2什么是基因组文库和cDNA文库？二者有哪两点主要区别？3根据所使用的载体的不同类型，基因文库分为哪四种？4举例说明基因组文库构建的基本步骤。5核酸杂交的基本原理是什么？什么是探针？用核酸杂交法筛选基因文库时，探针的序列是根据什么设计的？多克隆位点（MCS