九染色体工程

第九章染色体工程12什么是染色体工程？染色体工程（chromosomeengineering）：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。3第一节人工诱导多倍体第二节雌、雄核发育第三节染色体显微操作技术第四节染色体转移技术第五节人工染色体4第一节人工诱导多倍体技术方法倍性鉴定方法优点与缺点5多倍体（polyploid）是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。在自然界中，多倍体现象在高等植物中相当多，而动物界却少得多。1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。6一、技术方法7多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出产生三倍体，或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、物理和化学的方法得到多倍体。81.生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poeciliaformosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。这种不同科、属、种之间的远源杂交，会导致第二极体不排出，而产生多倍体。9包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。⑴温度休克法：冷休克法（0～5℃）和热休克法（30℃）。

定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。

关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法好，而温水性鱼类用冷休克效果较好。

优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。2.物理学方法10⑵水静压压法：采用较高的的水静压（（65kg/cm2）抑制第二二极体的放放出或第一一次卵裂来来产生多倍倍体。优点：诱导率高（（一般在90％～100％））、处理时时间短（3～5min），对对受精卵损损伤小、成成活率高。。缺点：需要专门的的设备———水压机，，成本较高高，其样品品室容量有有限，处理理卵的量有有限，所以以不适于大大规模生产产的。11有些化学物质也可以用来来阻止第二二极体的排排出或受精精卵的有丝丝分裂而产产生三倍体体或四倍体体。细胞松驰素素B：能抑制肌动动蛋白聚合合成微丝，，从而抑制制细胞质分分裂。秋水仙碱：：可以抑制细细胞分裂中中纺缍丝的的形成，因因而抑制有有丝分裂。。其它药物：：N2O、CHCIF2和聚乙二醇醇等。缺点：化学药品一一般比较昂昂贵、且具具有毒性，，影响处理理后的胚胎胎发育，同同时加上化化学药物诱诱导产生的的多倍体往往往是在育育种上没有有价值的镶镶嵌体，所所以化学方方法在实际际中的应用用不及物理理方法。3.化学学方法12二、倍性鉴鉴定方法13间接法：核体积测量量、蛋白质质电泳、系系列化学分分析、形态态学检查等等；直接法：染色体计数数、DNA含量测定定等。14核体积测量量：二倍体/三三倍体核体体积之比为为1:1.5，二倍倍体与四倍倍体的核体体积之比为为1:1.74。核核体积测量量法省时、、简单，在在生产现场场就能进行行而广为人人们采用，，但缺乏准准确性，亦亦测不出嵌嵌合体，往往往需要校校正；生化分析：：如在关东系系银鲫中，，三倍体红红血球的丙丙酮酸激酶酶的含量含含著高于二二倍体。15染色体计数数：是鉴定多倍倍性倍性的的一种最为为准确、直直接方法，，但缺点是是费时；DNA含量量测定：流式细胞仪仪。是较为为先进常用用的方法，，其测定快快速准确，，并能测出出嵌合体，，但需要特特殊的仪器器设备。采用何种方方法均有利有弊，进行鉴定定主要依赖赖于所测样样本的发育育时期、实实验要求和和所具备的的仪器设备备条件。16三、优点与与缺点17多倍体育种种技术方法法简单、见见效快，具具有潜在的的理论和应应用价值。。许多诱导的的多倍体动动物如两栖栖类、鱼类类、贝类等等都具有良良好的生存存力和生长长率。种间杂种生生长快，可可以同时具具有两个不不同的种的的优良特性性。利用三倍体体不育的特特性，将生生殖腺发育育消耗的能能量用于动动物生长，，可以避免免因繁殖季季节及肉质质下降而延延误上市时时间或影响响商品价值值，缩短了了养殖周期期，减少了了养殖成本本，这在鲍鲍鱼、昆虫虫等方面已已有应用。。某些多倍体体动物肉质质量、含氧氧量、抗病病性等经济济性状较二二倍体好。。1.优点点18准确的处理理时间；诱导率、成成活率及孵孵化率的提提高；准确可靠的的倍性鉴定定方法的确确定。2.缺点点19第二节雌雌、雄核发发育人工诱导雌雌核发育的的方法雌核发育的的鉴别雌核发育的的意义人工诱导雄雄核发育20雌核发育（gynogenesis）是单性性生殖的一种种，指卵子依依靠自己的细细胞核发育成成个体的生殖殖行为。同种种或异种精子子进入卵内只只起刺激卵子子发育的作用用，不形成雄雄性原核和提提供遗传物质质，其子代的的遗传物质完完全来自雌核核，只具有母母本的性状。。自然界中一些无脊椎动动物和鱼类等等存在。人工诱导雌核发育是指指用经过紫外外线、X射线线或γ射线等等处理后的失失活精子来““受精”，再再在适当时间间施以冷、热热、高压等物物理处理，以以抑制第二极极体的排出，，使卵子发育育为正常的二二倍体动物。。21凡雌核发育的个体，都具具有纯母系的的单倍体染色色体组，依赖赖于卵子染色色体组的二倍倍体化。1911年，，赫特威氏就第一个成功功地人工消除除了精子染色色体活性，并并发现了“赫赫特威氏效应应”。赫特威氏效应应指只有在适当当的高辐射剂剂量下，才能能导致精子染染色体完全失失活，届时精精子虽能穿入入卵内，却只只能起到激活活卵球启动发发育的作用。。22一、人工诱导导雌核发育的的方法23物理方法：采用射线包括γ射线、X射射线（效果较好）和紫外线（效果较差）等处理精子使使精子的遗传传物质失活。。化学方法：采用化学物质质如甲苯胺蓝蓝、乙烯尿素素和二甲基硫硫酸等消除精精子染色体遗遗传活性的方方法。显微手术法：：采用显微操作作的方法直接接去除受精卵卵中雄性原核核的方法。1.精子遗传传物质的失活活24阻止第一次有有丝分裂或第第二极体的外外排；利用温度、压压力或化学方方法，如冷休休克、热休克克、流体静水水压、细胞松松驰素B、聚聚乙二醇处理理等。2.雌核染染色体体数目目减少少的阻阻止25首先将将两个个不同同品系系的近近交系系进行行杂交交。交配后后，在在精核核与卵卵核尚尚未融融合之之前，，从母母鼠子子宫内内冲取取受精精卵，，并用用极细细的吸吸管将将精核核去掉掉。在细胞胞松驰驰素B的处处理下下使雌雌核加加倍，，形成成二倍倍体细细胞。。二倍体体细胞胞在体体外培培养到到囊胚胚期后后，移移植到到养母母的子子宫内内，使使胚胎胎继续续发育育，直直至出出生。。26二、、雌雌核核发发育育的的鉴鉴别别27鉴别别雌雌核核发发育育的的个个体体，，通通常常以以颜色色、形态态以及生化等方面的的指标为为依据。。也可以以通过细胞学的的研究，如若是是雌核发发育，其其囊胚细细胞中只只出现一一套来自自雌核的的染色体体，否则则雌核和和雄核染染色体各各占一半半，得到到的是杂杂交种。。用遗传标志志的方法来来鉴别雄雄核发育育的二倍倍体化，，即由第第一次有有丝分裂裂的阻碍碍，还是是由保留留极体而而来。假假如二倍倍体源自自第一次次有丝分分裂的抑抑制，杂杂合雌性性个体的的子代应应该都是是纯合型型；而如如果是通通过阻止止第二极极体的外外排产生生的雌核核发育个个体，则则子代的的情况取取决于着着丝点与与基因间间的距离离。在着着丝点与与基因距距离远离离时，将将明显增增加杂合合型子代代的比例例。28三、雌核核发育的的意义29为生产单性性种群提供了可可能。能迅速地地产生同源型二二倍体。提供某些些致死突变变种的生物物品质。。在农牧渔渔业生产产中，可可人工控制制性别繁繁殖。广泛地用用于进行行基因-着着丝点的的定位研研究。可利用产产生新的的纯系来来筛选除去去有害的的等位基基因。30四、人工工诱导雄雄核发育育31雄核发育育（androgenesis））是指因因经过紫紫外线、、X射线线或γ射线处处理的卵卵子与正正常的精精子受精精，再在在适当时时间施以以冷、热热或高压压等物理理处理，，使进入入卵子内内的精子子染色体体加倍，，而发育育为完全全为父本本性状的的二倍体体。雄核发育育的个体体的生存率非非常低，这是由由于精子子基因型型的纯合合性、卵卵子由于于照射的的损伤和和阻止第第一次卵卵裂处理理的损伤伤等原因因造成的的。但是仍旧旧在遗传传学基础础理论和和育种中中都有一定的价值值，利用雄核生生殖的精子可可用于冷冻基基因库，保存存种质资源，，对基因世代代克隆系的建建立，不同种种间核质的杂杂种的产生和和YY雄性引引起的性别控控制等也有特特殊的意义。。32第三节染色色体显微操作作技术染色体分离染色体微切割割331.原理：由于荧光染料料Hoechst只对对A-T特异异性染色，而而染料Chromomycin只对对G-C特异异性染色。染染色体上DNA的碱基序序列是不同的的，因此这些些特异性染料和和不同染色体体上DNA结结合的量和比比例是不同的的。结合这些染染料后，再经经激光照射，，染色体就会会呈现不同的的荧光带。将将特定染色体体发出的荧光光波长输入计计算机，通过过计算机控制制就可将发出出同一波长的的染色体收集集在一起，从从而实现染色色体的分离。。一、染色体分离34细胞分裂同步步处理染色体的荧光光色素染色染色体分离2.染色体分分离的具体步骤3536微细玻璃针切切割法：采用特细的玻玻璃针（尖端端直径约为0.17μm）在倒置置显微镜下对对目的基因所所在染色体区区段进行切割割与分离。显微激光切割割法：将染色体标本本在底部贴有有特殊薄膜的的培养皿上制制作，利用激激光共聚焦扫扫描显微系统统，依靠高能能量激光照射射非选择细胞胞或染色体，，使其受热蒸蒸发，最后只只留下目的染染色体。二、染色体微切割割37第四节染色色体转移技术术微细胞介导的的基因转移法法染色体介导转转移法38将同特定基因因表达有关的的染色体或染染色体片段转转入受体细胞胞，使该基因因得以表达，，并能在细胞胞分裂中一代代又一代地传传递下去。该该技术称为染色体转移（或染色体转导）。微细胞介导的的基因转移法法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色体介导的的基因转移法法（Chromosomemediatedgenetransfer，，CMGT））39一、微细胞介介导的基因转转移法微细胞（或微核体）：是指含有一条条或几条染色色体，外有一一薄层细胞质质和一个完整整质膜的核质质体。供体：微细胞优点：简化供体基因因的表达、对对受体细胞影影响小、微核核染色体稳定定40微细胞制备微细胞融合411.微细胞胞的制备用化学药剂和和（如秋水仙素）阻断供体细细胞的有丝分分裂，使染色色体停滞在有有丝分裂中期期，从而在染染色体周围逐逐渐形成核膜膜而成为众多多的微核。然后在细胞松弛素B的作用下使微微核逐渐突出出细胞膜外。。最后经过离心获得含有一一个微核、、四周有一一薄层细胞胞质和质膜膜界限的微细胞。422.微细细胞的融合合制备的微细细胞胞只只能能存存活活几几个个小小时时，，但但经经融融合合可可使使其其成成为为能能够够存存活活的的整整体体细细胞胞。。常采采用用PEG作为为细细胞胞融融合合剂剂。。最好好选选用用带带有有营养养缺缺陷陷标标志志的受受体体细细胞胞。。由于于微微细细胞胞的的染染色色体体含含有有互互补补的的原原养养型型基基因因，，微微细细胞胞与与受受体体细细胞胞形形成成的的杂杂合合细细胞胞即即可可在在特特定定的的选择性培养基基中生长而被筛筛选出来。43染色体介导转转移法：是指分离得到到相应的染色色体后转入受受体细胞的一一种技术。基本步骤：⑴⑴诱发细胞同步步分裂；⑵阻断细胞分裂裂于中期；⑶破碎细胞；⑷离心收集中期期染色体；⑸通过适当的分分类转移到受受体细胞中去去。二、染色体介介导转移法44细胞同步化与与染色体的分分离染色体的转移移受体细胞的分分离与鉴定染色体介导转转移的过程451.细胞同同步化与染色色体的分离用秋水仙素及及合适的酶处处理对数生长长期的细胞离心收集中期期相细胞沉淀淀洗涤数次在中性缓冲液液中培育用注射针喷射射细胞，使染染色体释放离心收集染色色体沉淀蔗糖梯度离心心或用流式细细胞测量仪分分离单条染色色体462.染色体体的转移染色体可以通通过细胞的吞噬作作用而进入受体细细胞。一般先先采用磷酸钙钙和染色体一一起沉淀，再再用二甲基亚亚砜处理受体体细胞，或采采用卵磷脂与与胆固醇制成成的脂质体将将染色体转入入受体细胞。。47分离：利用选选择性培养基基进行筛选鉴定：染色体组型分分析同工酶分析其他方法3.导入基基因的受体细细胞的分离与与鉴定48第五节人工工染色体49染色体体要确确保在在细胞胞分裂裂中保保持稳稳定，，必须须要能能够自自我复复制和和向子子细胞胞中平平均分分配。。它需需要3个关关键序序列，包括括自主复复制DNA序列列（autonomouslyreplicatingsequence，，ARS）、着丝粒粒DNA序序列（centromereDNAsequence，，CEN）和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。50将3个关键键序列用分分子生物学学方法拼接接起来就得得到人造微小染染色体（artificialminichromosome），在在大片段DNA分子子的克隆、、基因组分分析、基因因功能鉴定定、基因治治疗以及研研究染色体体结构与功功能关系等等研究中得得到了广泛泛的应用，，具有极为为重要的价价值。目前前，正在研研究或应用用的有：酵母人工染染色体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳动物人人工染色体体（mammalianartificialchromosome））51基于ARS、CEN、TEL是线性染染色体稳定定的功能序序列，人们们利用这些些序列构建建载体，重重组后的DNA以线线性状态存存在，这样样不仅稳定定，而且大大大提高了了插入外源源基因的能能力，并且且可以像天天然染色体体一样在寄寄主细胞中中稳定复制制和遗传，，称为人工染色体体。如利用从从酵母染色色体上分离离的ARS、CEN、TEL序列构建建载体，然然后用这种种载体构建建的染色体体即称为酵酵母人工染染色体。52

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5455本章内容到到此结束谢谢大家欢迎研讨56【复习思考考题】经常采用的的人工诱导导多倍体形形成的手段段有哪些？？要达到实验验条件下二二倍体雌核核发育目的的需要解决决哪些问题题？选择、判断断题：1911年年，人工条条件下，第一个在适适当的高辐辐射剂量下下成功地人人工消除了了精子染色色体活性，，导致精子子染色体完完全失活。。A.赫特特威氏B.沃克克C.克克拉克D.摩摩尔根多倍体的鉴鉴定不宜采采取的方法法是。A.核体体积测量B.染染色体计数数C.血血平板计计数D.利用用血液成分分、酶的含含量等进行行生化分析析温度休克法法包括冷休休克法（0～5度））和热休克克法（30度左右））两种，即即用略高于于或略低于于最适温度度的冷或热热休克来诱诱导三倍体体或四倍体体的方法。。测定细胞核核体积对细细胞多倍体体进行测定定属于直接接法。579、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。1月-231月-23Friday,January6,202310、雨中中黄叶叶树，，灯下下白头头人。。。17:33:4017:33:4017:331/6/20235:33:40PM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。1月-2317:33:4017:33Jan-2306-Jan-2312、故人江海别别，几度隔山山川。。17:33:4017:33:4017:33Friday,January6,202313、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。1月-231月-2317:33:4017:33:40January6,202314、他乡生白白发，旧国国见青山。。。06一月月20235:33:40下下午17:33:401月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月235:33下下午1月-2317:33January6,202316、行动出成成果，工作作出财富。。。2023/1/617:33:4017:33:4006January202317、做前前，能能够环环视四四周；；做时时，你你只能能或者者最好好沿着着以脚脚为起起点的的射线线向前前。。。5:33:40下下午5:33下下午午17:33:401月-239、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。1月-231月-23Friday,January6,202310、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。17:33:4017:33:4017:331/6/20235:33:40PM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。1月-2317:33:4017:33Jan-2306-Jan-2312、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留留一一份份不不足足，，可可得得无无限限完完美美。。。。17:33:4017:33:4017:33Friday,January6,202313、不知香积积寺，数里里入云峰。。。1月-231月-2317:33:4017:33:40January6,202314、意志坚强的的人能把世界界放在手中像像泥块一样任任意揉捏。06一月20235:33:40下午17:33:401月-2315、楚塞塞三湘湘接，，荆门门九派派通。。。。一月235:33下