7第3章基因工程第9、10节

第7第3章基因工程第9、10节

生物技术制药36讲

第九节基因工程药物的质量控制是利用活细胞作为表达系统,产是利用活细胞作为表达系统,物的分子量较大,物的分子量较大,并有复杂的结还参与生理功能的调节,构,还参与生理功能的调节,用量极微,量极微,任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害.贻误病情造成严重危害.

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宿主细胞中表达的外源基因,宿主细胞中表达的外源基因,在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化,中都可能发生变化,故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量.制条件和鉴定质量.

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一、原材料的质量控制原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性序列的正确性,药品的DNA序列的正确性,重组微生物来自单一克隆,所用质粒纯而生物来自单一克隆,稳定,稳定,以保证产品质量的安全性和一致性.一致性.

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根据质量控制要求应了解以下特性：特性：明确目的基因的来源、克隆经过,⒈明确目的基因的来源、克隆经过,并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；

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⒉应提供表达载体的名称、结构、遗应提供表达载体的名称、结构、传特性及各组成部分(如复制子、传特性及各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能,启动子)的来源与功能,构建中所用位点的酶切图谱,用位点的酶切图谱,抗生素抗性标记物；记物；应提供宿主细胞的名称、来源、⒊应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、传代历史、检定结果及其生物学特性；

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⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；遗传稳定性；⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列,详细叙述控制区内的核苷酸序列,在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等.主细胞中表达的方法及水平等.

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二、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中,在工程菌的贮存中,要求种子克隆纯而稳定；克隆纯而稳定；在培养过程中,在培养过程中,要求工程菌所含的质粒稳定,始终无突变；含的质粒稳定,始终无突变；在重复生产发酵中,在重复生产发酵中,工程菌表达稳定；达稳定；始终能排除外源微生物污染.始终能排除外源微生物污染.

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生产基因工程产品应有种子批系统,批系统,并证明种子批不含有致癌因子,无细菌、病毒、癌因子,无细菌、病毒、真菌和支原体等污染,支原体等污染,并由原始种子批建立生产用工作细胞库.建立生产用工作细胞库.

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原始种子批须确证克隆基因DNA序列

详细叙述种子批来源、序列,DNA序列,详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期,方式、保存及预计使用期,保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性.定性.

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对生产种子,应详细叙述细对生产种子,胞生长与产品生成的方法和材料,胞生长与产品生成的方法和材料,并控制微生物污染；并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据,产浓度与产量恒定性数据,依据宿主细胞-载体系统稳定性,宿主细胞-载体系统稳定性,确定最高允许传种代数；最高允许传种代数；

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在培养过程中,应测定被表在培养过程中,达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性,规定持续培养时间,恒定性,规定持续培养时间,并定期评价细胞系统和产品.并定期评价细胞系统和产品.

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培养周期结束时,应监测培养周期结束时,宿主细胞-载体系统的特性,宿主细胞-载体系统的特性,如质粒拷贝数、如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度,达载体存留程度,含插入基因载体的酶切图谱等.载体的酶切图谱等.

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三、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据,确证提纯物分物学试验数据,子批间保持一致性；子批间保持一致性；外源蛋白DNA与热源质控制在规定质、DNA与热源质控制在规定限度以下.限度以下.

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在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质,身引入的化学物质,并有检测方法.方法.

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四、目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、包括以下几项要求:产品的鉴别、纯活性、安全性、度、活性、安全性、稳定性和一致它需要利用生物化学、免疫学、性.它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法.鉴定方法.

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⒈产品的鉴别常用的鉴定方法:常用的鉴定方法:电泳方法:SDS、等电聚焦、电泳方法:SDS、等电聚焦、免疫电泳免疫学方法:放射免疫(RIA)、免疫学方法:放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)免疫(ELISA)受体结合试验高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、圆二色谱、末端序列分析、圆二色谱、核磁共振

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⑴肽图分析肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析.它是检测蛋白

质一级结构最有效的方法,的方法,该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法.常用HPLC、评价和验证的首选方法.常用HPLC、毛细管电泳.毛细管电泳.

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⑵氨基酸成分分析50个氨基酸较理想50个氨基酸较理想⑶部分氨基酸序列分析N端15个氨基酸可作为重15个氨基酸可作为重组蛋白