双模式超声血栓溶解疗法及效果光学定量评价研究

独创性声秉承学校严谨的学风与优良的科道德，本所呈交的是中特别加以标注和致谢的地方外，中不含其他人已经或撰写我一同工作的对本做的任何贡献均已在中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名 日期保护知识产权声校攻读期间工作的知识单位属第四。本人保证毕业学校可以公布的全部或部分内容（含，内容除外，可以作者签名 导师签名 日期 师：曹铁生教古幡博教授：超声溶栓治疗;超声诊断;定量评价法;经颅多普勒第四200805 缩略语 中 英 文献回 超声增强溶栓的实验......................................................................... 经颅多普勒超声技 经颅彩色双工超声技 动脉内超声装 治疗性低频超 微泡强化超声溶栓技 实验一双模式超声溶栓促进作用及血流监测效 引 主要材 方 结 讨 实验二超声溶栓作用光学定量、定位 引 主要材 方 结 讨 参考文 个人简历和研究成 个人简 研究成 的与相关的主要学术...............................................申请发明专 缩略英文全称中文全称HighfrequencyPowerMotionSpatialpeaktemporalaverageSpatialaveragetemporalaverageSpatialpeakpulseaveragetissueplasminogenPhotogreenGreenlightExposure值ClotClotthicknessUltrasonicthrombolyticenhancement为了提高超声溶栓治疗的安全性、有效性，我们设计了一种治疗与诊断双模式超声溶栓(DMUT)系统。其空间峰值时间平均功率（ISPA）FDA1/3(I)1/6tA统也有显著的溶栓促进作用。这既为临床应用TCD促进血栓溶解找到了部：超声溶栓治疗;超声诊断;定量评价法;经颅多普勒StudyaboutDualModeUltrasonicThrombolysisMethodandOpticaltativeEvaluationMethodforToimprovethesafetyandefficiencyofultrasonicthrombolysis,wedesignedadualmodeultrasonicthrombolysis(DMUT)system.Itsspatialpeaktemporalaverageintensitywasonly1/3ofthatoftheup-limitclearedbyFDA,anditsmechanicindexwasonly1/6thatoftheclearedlimit.Itwasalsospatiallyandtemporallyrestrictedtoavoidtheformingofstandingwaves.ItseffectinenhancementofTPAthrombolysiswasconfirmedbyexperimentswithaninvitroflowmodel,anditsabilitytoprovideDopplerinformationofthebloodflow,whichcanbeusedtoaimingthetherapeuticultrasoundbeamandmonitoringtherecizationprocess,wasalsoFurther,wealsodesignedanewopticaltativeevaluationmethodforultrasonicthrombolysis.Itmadeuseofphotographytodeterminethethicknessofclotbyexaminingthephotobrightness.Withrelativelysimpleoperationandless alinterference,ithadarathergoodreproducibility,andcoulddifferentiatethethicknesschangesofdifferentpartsofthesoundfield.BythismethodwesuccessfullydemonstratedthatacommonTCDdiagnosticsystemhavetheabilitytoenhancethethrombolysissignificantly,thusprovidedthesupportfortheclinicaluseofTCDforsuchobjectivesandshowedthehighsensitivityofthismethod.：ultrasonicthrombolysis;ultrasonicdiagnosis;tativeevaluationmethod; 发症较多；费用也很高。及时应用血栓溶解剂（如TPA），可以者闭塞血管的再通率，缩短再通时间。但是其临床效果仍然远不能令人满意：首先，静脉给与TPA只能使10%的颈内动脉栓塞及30%的大脑中动脉栓塞患者实现再通，而且可能诱发脑等并发症。因此，临床迫切需要探索一有鉴于此，我们与东京慈惠会医学及Spencer公司合作，1-3均未发现显著的临床康复。紧接着的有关组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,TPA)的一试验4-7在预定的终点——治疗后2小时及24小时也均未发现各组之间有任何差异。不过，NINDS试验82427%TPANIHSS评分提高了1010分以上的患者只有早期临床康复通常发生于动脉再通之后9-12。一篇最近的综合分析研究者通过实验模型证实16-20。这些研究中使用了多种超声强度（0.2-2.0W/cm2）及多种超声频率（从20kHz到2MHz)。超声能够促进液体在血栓周超声产生的压力波也可以促进TPA进入纤维蛋白网格。此外，超声直接促进TPA与纤维蛋白网格的结合，并同时削弱纤维蛋白的交联22便于携带的2MHz的经颅多普勒(TCD)诊断装置可以拿到室持续监向血流等）作为其他影像，比如CT血管造影的有力补充28。TCD监测中存在颅内血栓的部位，实时监测动脉的再通过程26。Alexandrov等用2MHzTCD持续地监测TPA输注，结果发现早期再通及显著恢复率高于预期。德国31及法国32的其他研究组也发现不适合TPA治疗的急性大脑中动脉阻塞经颅多普勒超声技术CLOTBUST试验（CombinedLysisOfThrombusinBrainischemiausing验，中心分别位于休斯敦（、巴塞罗那（西班牙、及埃德蒙顿与卡尔加里（）31。其有预先确定的安全性及有效性终点，并预先确定每组被随机分配到持续TCD监测组（观察组）及假监测组（对照组。安全性终点是症状性颅内（symptomaticintracranialhemorrhage,sICH）引起神经功能加重，NIHSS增加4分以上。早期的有效性终点包17分。两组患者的、阻塞部位及开始治疗的时间相似。症状性颅内在观察组及对照组均为4.8%。31名观察组患者(49%)及19名对照组患者（P=0.03的对照患者获得了理想的恢复(mRS0-1分，P=0.2。经颅彩色双工超声技术，该研究组及其他研究组33-35，不适合系统TPA治疗的患者也可能受动脉内超声装置现在已有公式将超声探头集成到动脉内溶栓给药导管（NeuroWave的脉冲超声，400mW，参数类似于颅外应用的TCD。在Mahon等的研究中36，导管放置在血管的近段部分，在TPA2mgT连续灌注(0.3mg/m20mg)声照射60min。5例MCA栓塞患者和5例颈内动脉远端及MCA混合闭塞患者在症状发生后6h4例后循环脑卒中患者在发病24h在最初1h内57%(8/14)患者达到TII分级23级血流；平均再通时间46min，成微流，增加了血栓对溶栓药物的面。这种EKOS导管正在接受IIIII期临床试验37。导管输送动脉内超声是最有效的局部定位给予TA的方法。然内。治疗性低频超声但是TRUMI（Tnrnial lowfrquny UltroundditedthrombolysisinrinIhmia)临床试验显示了治疗超声的性40。该试验采用30015kH的超声超声强（时间平均间峰值强度是700m/m2，采用脉冲波占空比5%脉冲复频率10超声在静脉给与T的同时，及TA输注后30分钟内应用，总的治疗时间是90min。结果该试验被迫提前中止因为在观察组36%的患者出现了症状性颅内并且该治疗没能改善早期再通及3个月疗效指标研究者在T+US组患者的蛛网膜下腔脑室及远离梗死灶的间质等部位发现了大量的型。的脉冲平均强度、过大的声束面积、及过长的脉冲长度有关。TRUMI试验所使用超声的空间峰值脉冲平均强度为14/m2648kPa（MI应该是1.180.2采用4个直径30mm的超声换能器，发射面积是普通TD超声探头(直径约14mm)的1818倍的声能送入颅内（低频超声远较高频超声容易进入颅内。再加上该超声具有765mm的脉冲长度，这种长度I发显著的空化作用、从而导致颅内损伤及水肿41-42。实际上Auma等43617k发微泡强化超声溶栓技术已有几项研究使用了不同的已经商业化的微泡47-50。olina等47率先在中风患者中展此项究，并了迄今该领域规模大的研。其究显示，T团注2小时后，TA+TDvovit组取得了55%率，而相当于TBUS试验的TAT组的该指标只有38%。一项小规模的二期随机临床试验了给接受超声助溶的患者输入一种新的、更加稳定的八氟甲烷(3F8)脂质微泡的安全性与可行性48。值得注意的是，在75%的患者中，微泡到达了治疗前没有残存血流的区域，在83%的患者残存血流速度在微泡输入30mi（30到120min血流速度加快了17m/（中间值18%(TA+TCD+微泡)及对照组(TPA+TCD)均未出现症状性颅内（sICH。另围的残存血流（39.811.3versus28.813.8cm/s,P<0.001)51。治疗组有大量的无症状型颅内（78%，出于安全原因而中途停止。明过高的性改变是由双工超声还是微泡所引起。Sequoia；,Malvern,PA)监测60min。与只用TPA治疗的患者相比，接强剂的各种组合形式数量非常之多，而现有的离体实验技术主要采用称 实验 引多数研究表明，千赫级低频超声具有较强的溶栓及助溶作用，而且热损近的一次临床试验(TUI)40却将其与过高的颅内联系到一起，使人对其安全性产生怀疑。我们认为这其实很可能只是由于所选超声的声束过宽、过强、脉冲过长所致。另一方面，一般认为兆赫级超声溶栓效果较差，TBUST）312MHzTD本实验其离体溶栓促进作用及血流监测效果。主要材血流模型材料由慈惠会医学仪器室制，长32cm，宽21cm，高19cm200μL移液吸头（Pipette规格号118-96RN;由加利福尼亚州Petaluma市PorexBioProducts规格号TS-TR1K,由东京テルモ㈱提供50ｍＬ医用塑料注射50mL规格号model707;由提克州Bridgeport市ATSLaboratories血栓形成材料牛血浆（bovine规格号P4639;由密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司提供氯化钙规格号SigmaUltraC5080;由东京Sigma-Aldrich公司提供牛凝血酶（bovine规格号T4648;由密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司提供微量注射器（micro血栓溶解剂一种重组TPA，商品名：Cleactor;由东京Eisai公司提供超声装置ＤＭＵＴ型号4166A101;向法国Besançon的Imasonic公司定制功率型Ｍ 型号4055；由横滨NFElectronics㈱提供 1.4.6使探头的中心线正好穿过血栓的。方流路系统50mL注射器抽去活塞后作为灌流液（生理盐水或多普勒测试液）的容栓（血栓方法见下节。在以下实验A及实验B中，流路系统充填生理盐的压力阶差可以产生约9-10mmHg/mm的压力梯度，类似于Ishibashi等55的血栓的及TPA的导血栓的方法根据Spengos等23以及Behrens等24的方法改进得到。简单介绍如下：首先用一台微型打磨机(AC-D7;Sunhayato,Tokyo,Japan)将200μL的移液吸头的下端两侧，距出口3-15mm处打磨至约0.2mm混合液注入200μL的移液吸头的下端附近。在37°C孵育30min。接着，在形成的血浆性血栓的上端注入400μL新鲜配置的含有340μL牛血浆及60μL4000IU/mL的monteplase（最终浓度600IU/mL）的混合液。然后，移液吸头被小双模式超声溶栓（DMUT）系统构建及其声场特性我们使用一个新开发的DMUT探头(4166A101;ImasonicCo.,Besançon,的中心频率是550kHz，用于低频超声治疗，前端的换能器的中心频率是 ,Tokyo,Japan)，2MHz换能器连于一台PMD超声成像仪(PMD100;SpencerTechnologies,Seattle,WA,USA)，550kHz换能器连于一 ,Tokyo,Japan)及功率放大器(No4055;NFElectronic,Yokohama,Japan)。在模式转换控制仪与550kHz换的输出功率采用超声功率计(UPM-DT-1,OhmicInstrumentsCo.Easton,MD,USA)测定，声束剖面图采用声场强度测试系统(AIMS,NTRSystemsInc.Seattle,WA,USA)及一个0.5mm有效直径的水听器(NH8067,TorayEngineeringCo..Tokyo,Japan)测定。结果如图2所示。PMD声束的空间峰值时间平均强度(ISPTA)是0.192W/cm2,脉冲重复频率(PRF)是8kHz，占空比是6.4%.其空间峰值时间峰值强度(ISPPA)是3.0W/cm2,机械指数（MI）是0.21.低频治疗声束的ISPTA是0.22W/cm2,，PRF是2kHz，占空比是11%.其ISPPA是2.0W/cm2,MI是0.33在模式转换控制仪的控制下本双模式超声溶栓系统交替地使PMD工作5s，然后使低频超声工作10s.所有超声治疗实验在上述水槽中进行。采用一个定做的金属固定器(Nogatadenki,Tokyo,Japan)实验A:单独应用应用低频超声)2MHz（ISATA），根据超声功率与声束截面的比近似计算56是大约180mW/cm237°C。然后，在打开三向开关的同时，开启超声照射。通过末端的刻度吸3mL/min实验B:DMUT双模式应于上述实验A中PMD的ISATAPMD的ISATA只有约69mW/cm2,远低于实验A中的180mW/cm2。远离声束。这样，经过9次实验，获得DMUT治疗组9例，其相应对照组实验C:再通过程的监在本实验中，将灌流液由生理盐水改为多普勒测试液(model707;ATSLaboratories,Bridgeport,CT,USA)，其余设置同实验A。再通前后PMD统计学处理采用StatView5.0SASInstituteCary,NCUSA)进行统计学处理。再通时结再开通的时间过程者都是p=0.0004）。在PMD组与对照组之间无统计学差异(p=0.7996)。再开通“血流”的监测效果如图4所示，当血栓逐步溶解，达到再开通通道建立时，多普勒测试液向过移液吸头，功率型M模式多普勒及频谱多普勒均显示出明亮、清晰讨的1/3，而且血栓部位PMD的ISATA只有69mW/cm2，远低于PMD单独实验时41.6%。但是他们所使用的185kHz的连续波LFU许多动物实验显示FU可以缩短再通时间而没有明显的副作用457。然而I试验报告却示40梗塞者脑率只用时的上升到FU与PA并用时的9%；而且严重的脑只见于并用组(6)。ihrd(20)通过磁成象（MRI、电子发射成像E)以及经颅多普勒TD)检查也显示TUI中所使用的FU可以引起血脑屏障的开药的2h经颅多普勒监测可以使再通率从(30%)明显升高到49%31。通常，U颅骨时，比H衰减小，的能量可以到达脑组织，所以必须十分注意高强度、宽声束、长脉冲持续时间的FU的使用。在诊断超声中确定的安全强度并不能保障FTUMI试验使用的ISA是0.7/cm2接近于FD56对诊断超声所明确的安全限度(0.72/c2)。TUI超声的ISA是14/cm2换算成MI是1.18,超出了通常认为的I1.0的安全标准。我们知道，FDA给出的I安全标准是.9，但这只是适用于超声诊断设备中广泛使用的短脉冲长度超声。除了使用长达765mm的脉冲长度，TUI试验使用4个直径30mm的换能器发射超声，导致巨大的声束发射截面。该声束发射截面是普通TCD探头(直径约14mm)的大约18倍。这样的脉长度与宽度很容导致声在颅内时由于颅骨射而A为诊断设备所确定的I19的安全上限。尽管导致了脑的增加，TUI等试验并未显示超声增强溶栓的作用。其原因可能是过强的超声引发的脑水肿2以及颅内0，41导致了颅内压的增高，这将降低血栓前后的。在我们的DMUT系统中，LFU的ISPTA是0.22W/cm2ISPPA是2W/cm2,而MI仅有0.33LFU声束的侧向及轴向尺寸均有限其有效声束宽度仅有大约12mm参见图2)84mm。这种脉冲形状不太本项研究没有发现多普勒超声对于血栓溶解有促进作用。这和OTBUST等临床试验有所31，47，其原因尚需要进一步探讨。比如，TBUS等临床试验采用的是接近闭塞但未完全LFU在血栓部位引起的粒子振幅是42nm，而PMD引起的粒子振幅只有1548mm实验 超声溶栓作用光学定量、定位引可能具有溶栓效果的超声的范围很广，从20kHzMHz,从连续波到16-2047。主要材实验动物及采血器械VenojectⅡ真空采血型号MN-SVS23BS,由东京TerumoCo.提供型号XX-VP010HD,由东京TerumoCo.提供阶梯式浅孔容器(steppedflat-part,径32mm，厚2.5mm。基底膜(5)以及盖膜(2)是厚度0.3mm的透明聚碳酸脂材料。血栓形成层(4)也是不锈钢材质，内径13mm,外径32mm，厚2mm。溶液装载层(3)是软质PVC塑料环，内径17mm,外径26mm，厚2mm。图 照相器材型号SmartSD-400，由东京LPL公司制造血栓厚度与光吸收关系测定器1.1cm，一端高0.2mm,另一端高3.2cm。恒温水槽血栓溶解剂Alteplase：又称TPA，商品名：GRTPA注射液,由大阪MitsubishiPharmaCo.提供。方血液、分离、预处理及保利用含有3.8%枸橼酸钠的真空采血管，通过带翼采血针套件及VenojectⅡ固定器从大白兔耳背动脉新鲜血液。将的血液在1000RPM离心10min。然后将分离出的血浆与红细胞分别吸入多个2mL冻存管(Screw-captubeASONEOsakaJapan)。部分血浆置于-20℃冰箱备用。部分血浆混入3%的红细胞置于4℃冷藏箱，用于一周内制作血栓。预实验1：量与相片亮度的对应关包绕镜头，向下接触灯板。采用手动模式，相机感度设置于ISO100,白平衡设置于5500K,光圈f/5.6，时间1/30s-1/2000s,相应的值是10-16EV。(按照摄影技术理论，0EV对应1s的时间及f/1.0的光圈。值每增加1，意味着量减少一半，可以通过使时间减半或光圈面积通过AdobePhotoshopCS(AdobeSystemsInc.,SanJose,CA,USA)的直方图窗口每 同样部位的约1cm2面积的绿色的平均亮度（photogreenbrightness，PGB)。值与PGB的关系用微软的Excel2003绘预实 2：血栓厚度，PGB，以及绿光吸收之间的关3%红细胞的血浆与0.25mol/LCaCl2(SigmaUltraC5080;Sigma-AldrichJapanCo.,Tokyo,Japan)，以及5U/ml的bovine(T4648;Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO,USA)按照8：1：1的比例迅速混匀，待血栓初步形成后，将楔形测定器移入37℃孵箱继续孵育30min。然后，图1.1此外，按以下步骤计算绿光吸收值（greenlightabsorbanceGLA)：首先将各PGB值按预实验1得到的关系式转化为相应量EV值，然后按下式计算GLA:GLA=(EV-10)*lg2≈(EV-10)*0.3GLA与血栓厚度的关系也用微软Excel-2003扁平血栓的制作与治疗前照相在每次实验前，将0.1ml0.25mol/L的CaCl2(SigmaUltraC5080;Sigma-AldrichJapanCo.,Tokyo,Japan),0.1ml的5IU/ml的bovinethrombin(T4648;Sigma-AldrichCoSt.Louis,MO,USA)以及0.8ml的含有3%红血球血浆依次加入一个2ml冻存管中，通过3迅速地每次取0.23ml混合液依次加入3个阶梯式浅孔容器(SFW)的血栓形成非常平整的表面。然后给SFW盖盖，室温放置5min让混合液初步凝固。然加入溶栓溶液以及密封在每一次实验前，将2.0ml冻存兔血浆与0.1ml的300,000IU/ml冻存alteplase(由GRTPA注射液配制,MitsubishiPharmaCo.,Osaka,Japan)在37℃孵箱融化。将1.3ml融化血浆与13μl融化alteplase混匀,取0.6ml混合液分别加入TPA组与TPA+US组SFW的溶液装载层孔中。另取0.6ml不含alteplase的冻融血浆加入对照组的溶液装载层孔中。然后将各SFW盖盖，并用胶带沿超声治疗与治疗后照相本实验测试了PMD超声诊断仪(PMD100；SpencerTechnologies,Seattle,WAUSA)及其聚焦探头(Φ14,焦距50mm)的溶栓增强效果。该装置能发射中心频率为2MHz的脉冲超声，脉冲重复频率(pulserepetitionfrequency，PRF)是8kHz,将采样容积设置为6mm时其占空比是6.3%。将输出功率设定为的其实际声功率是80mW50mm处的声场分布如图2所示。该图是利用一个声强测定系统(AIMS,NTRSystemsInc.Seattle,WA)及一个有效直径0.5mm的水(NH8067,TorayEngineeringCo..Tokyo,Japan)TemporalaveragedTemporalaveragedintensity(W/cm.0-8-7-6-5-4-3-2-101234567Distancefromthecenter(mm将TA+US组SFW与PMD探头固定于一个金属固定架(utommd;Nogtadnki,okyo,pn)PMD探头的中心线穿过SFWSFW中心点的距离保持在50mm。其余两个SFW也置于该固定37℃PMD探头的前端在水面下约2mm，而各SF在水面下约5mTA500SONEo.,saka,pn)控制在370.3℃一层5mm厚的橡胶板及6mm厚的网状塑料毡垫以最大限度地减少超声的反射干扰。超声治疗的时间是30min。相片观察、血栓厚度确定及指通过PhoohopS治疗前后相片，并通过PGB确定治疗前后SFW各处血栓的厚度。具体步骤是：首先用一个14mm14mm（真实尺寸）SFW列宽.2m，半径从.5mm到6mm的环形选区通道，以及一个直径0.2mm的SFWPGB2得到的PGPGB（clotthicknessdecrease，CTD)。用TPA+US组的血栓厚度减少值减去TPA组的UTER2.7统计学处Studentt-test进行均数差比较t-test进行差异的显著性验证。均以p<0.05作为差异显著性的标准。结值与PGB之间的关系PhotoPhotoGreen0 StandardExposureValue图3标准灯光背景下，值与PGB的关PGB=1.05EV3-38.3EV2+415EV-其相关系数EV=-6.17*10-7*PGB3+2.87*10-4*PGB2-6.14*10-2*PGB其相关系数血栓厚度与PGB及绿光吸收值之间的关系血栓厚度（CT）与PGB的关系如图4所示PhotoPhotoGreen ClotThickness图4.血栓厚度与PGB根据图4，已知血栓厚度可以计算相片的绿色的亮度（PGB，两者的关PGB=-2.65*CT3+33.3*CT2-其相关系数CT=1.96*10-9*PGB4-1.18*10-6*PGB3+2.71*10-4*PGB2-3.69*10-其相关系数2greengreenlightabsorption10 clotthickness2greengreenlightabsorption10 clotthickness从图5下图可以看出，当血栓厚度在0.5mm到2.5mm（CT）与绿光吸收值(GLA)之间呈良好的线性各处理组治疗前后形态变化 从左到右依次为对照组，TPA组，以及TPA+US泽均明显变淡、变亮；特别是TPA+US组治疗后血栓部位更加明显地变各处理组治疗前后各部位厚度的变化Distancefromthecenter图7.在距离中心0到3mm处,TPA+US组均较TPA组有非常明显的厚度减少（即前置处，均有p<0.001（p值分别是0.0004，0.0004，0.0003，0.0003，0.0003，p>0.05110Distancefromthecentertemporalaverageenhancementrate012345图 012345讨本实验结果显示，不加溶解剂的对照组血栓几乎没有任何厚度的变化。果显于的栓溶。栓实验中不加溶栓剂的对照组血栓在实验后也有明显的质量下其他两组血栓由于其疏水表面很快被溶解，就不存在上述问题了。10ΔGLA=H0/HGLA-GLA0=(EV-GLA00,所以GLA=(EV-EV=-6.17×10-7×PGB3+2.87×10-4×PGB2-6.14×10-2×PGBGLA=(-6.17×10-7×PGB3+2.87×10-4×PGB2-6.14×10-2×PGB+7)2.5PGB转化为光吸收，再转化为血栓厚度符合逻辑，也是我PGB的关系式，直PMD68的显示，我们可以清楚直观地感受到PMD声束的溶栓增强作用。回顾我们在本研究之前PMD的溶栓增强作用；而利用本实验技术，我验技术更加敏感、精确地捕捉到超声的溶栓增强作用。本项研究为Alexandrov31以及Molina47的临床研究中发现TCD能够促进脑梗塞患本研究的一项不足之处是，没有同时研究超声单独应用时对血栓的影响。而这一点对于进一步阐明超声的溶栓增强的作用机制显然具有重要作用。 超声溶栓(DMUT)系统。其空间峰值时间平均功率（ISPTA）只有FDA规定的1/3，机械指数(MI)只有最大允许值的1/6；tPA的溶栓作用，加快利用该方法，我们成功地证实，在离体条件下，普通TCD系统也有显TCD促进血栓溶解找到了部分依据，也delZoppoGJ,PoeckK,PessinMS,WolpertSM,FurlanAJ,FerbertA,AlbertsMJ,ZivinJA,WechslerL,BusseO. binanttissueplasminogenactivatorinacutethromboticandembolicstroke.AnnNeurolBrottTG,HaleyEC,LevyDE,BarsanW,BroderickJ,SheppardGL,SpilkerJ,KongableGL,MasseyS,ReedR.Urgenttherapyforstroke.PartI.pilotstudyoftissueplasminogenactivatoradministeredwithin90minutes.Stroke1992;23:632–640.HaleyEC,LevyDE,BrottTG,SheppardGL,WongMC,KongableGL,TornerJC,MarlerJR.Urgenttherapyforstroke.PartII.Pilotstudyoftissueplasminogenactivatoradministered91–180minutesfromonset.Stroke1992;23:641–645.TheNationalInstitutesofNeurologicalDisordersandStrokert-PAStrokeStudyGroup.Tissueplasminogenactivatorforacuteischemicstroke.NEnglJMed1995;333:1581–1587.HackeW,KasteM,FieschiC,ToniD,LesaffreE,vonKummerR,BoysenG,BluhmkiE,HöxterG,MahagneMH,etal.Intravenousthrombolysiswithbinanttissueplasminogenactivatorforacuteischemicstroke:theEuropeanCooperativeAcuteStrokeStudy.JAMAHackeW,KasteM,FieschiC,vonKummerR,DavalosA,MeierD,LarrueV,BluhmkiE,DavisS,DonnanG,SchneiderD,Diez-TejedorE,TrouillasP.Randomiseddouble-blindplacebo-controlledtrialofthrombolytictherapywithintravenousalteplaseinacuteischemicstroke(ECASSII):SecondEuropean–AustralasianAcuteStrokeStudyInvestigators.LancetHackeW,DonnanG,FieschiC,KasteM,vonKummerR,BroderickJP,BrottT,FrankelM,GrottaJC,HaleyECJr,KwiatkowskiT,LevineSR,LewandowskiC,LuM,LydenP,MarlerJR,PaS,TilleyBC,AlbersG,BluhmkiE,WilhelmM,HamiltonS;ATLANTISTrialsInvestigators;ECASSTrialsInvestigators;NINDSrt-PAStudyGroupInvestigators.Associationof 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