原核表达之引物设计

原核表达之

引物设计自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应(PCR)以来,PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一,而引物设计是PCR技术中至关重要的一环引物设计原则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计2.引物长度一般在15~30碱基之间3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃

Tm=4（G+C）+2（A+T）

4.引物3′端要避开密码子的第3位5.引物3′端不能选择A，最好选择T6.碱基要随机分布引物设计原则7.引物自身及引物之间不应存在互补序列8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰10.扩增产物的单链不能形成二级结构11.引物应具有特异性常用引物设计软件PremierPrimer5.0Oligo6.0VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPremierPrimer5.0主要功能:1.自动搜索2.引物设计3.限制性内切酶位点分析4.DNA基元(motif)查找5.同源性分析Oligo6.01.功能较PremierPrimer5.0更为单一，主要是引物设计及引物评价2.常与PremierPrimer5.0联合使用进行原核表达所用引物的设计原核表达引物设计实例分析鸭疫里氏杆菌（Riemerella

anatipestifer）ompA

登录NCBI：/共１１６４ｂｐ，按照把各位数字相加，除以３得整数，即可认为这一序列能编码完整的氨基酸序列鸭疫里氏杆菌ompA序列ATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAAACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAGACACGACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACTCAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATTTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAGATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAAACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGACAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTCCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTATATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACAACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATCTCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTGAAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGAATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATCTTCCAGTAGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA将基因序列复制粘贴到EditSeq软件内并保存将DNASequence翻译成氨基酸序列Control+A

选中DNASequence,点击“Goodies”>>>“TranslateDNA”查看有无信号肽（SignalPeptide）SignalP3.0Server:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/打开Oligo6.0点击“ｃｈａｎｇｅ”＞＞＞＞“CurrentoligolengthＦ９”

点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞

“ＰＣＲＡｌｔ＋Ｐ”点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞

“ＦａｌｓｅＰｒｉｍｉｎｇｓｉｔｅｓ”＞

“Ｕｐｐｅｒｐｒｉｍｅｒ”下拉滚动条，下一方块中的数值要求同上同样的操作查看”FalsePrimingSites”选项中“LowerPrimer”的各项数值是否合适点击“Edit”>