生化课件华科-上蛋白质

HCO+ O 蛋白质(Protein)复习:肽肽一肽（peptide）多肽肽的理化性蛋白质一级结肽的固相合1.11.1连接方式：肽键(peptidebond个氨基酸的羧基与另OOHHNHCCOH HNHCCOH O H HNCCNHCCNCCNHCC氨基酸顺N-末端ASHC-FVC氨基酸残基(aminoresidue)肽肽链方向性（从N末端指向C末端肽键具有部分双键的肽键不可自由旋转 NHCO及Ca、Cb共平面（肽平面）肽键比一般碳-氮单键短（肽键中的C-N键长为0.132nm，介于0.148nm（C-N）和0.127nm（C=N）之间肽肽肽肽一肽（peptide）多 两个氨基酸缩合形成二肽，三个氨基酸缩合形成三肽由几个至十几个基酸相连而的肽称为寡ip),由 的氨基酸连形成的肽为多ppd)1.2肽的理化性质①肽键中的游离末端α-H、α-CH及侧链R基上的可解离基团pKaα-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端⑤双缩尿反应：两个或两个以上肽键化合物与CuSO碱性溶液1.21.2肽的理化性质⑥肽的水解非特异水解H+、OH-（高温）如6NHCl11012-24h完全水解，即所有的H如：rpin、Ppin等 非特异：如肼肽二硫生物活性肽肽类激素：催产素、加压素抗生素：短杆菌肽S神经肽：脑啡Phe短杆菌肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Leu-脑啡GlnS+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Met-脑啡Gly加压美籍化学家VincentduVgneaud已美籍化学家VincentduVgneaud已ILe正是由于这项成果，Vincent GlnSGly1.3蛋白质一级结构（primarystructure)：指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序；主要靠肽键维系，有些包含二硫键。1.31.3测定蛋白质的一级结构的要样品必需纯（>97%以上知道蛋白质的分子量（误差蛋白质一级结构(Primarystructure)测定包括：多肽链的氨基酸顺多肽链内或链间二硫键的数目能的基础。1.3氨基酸序列测定的第一人:FSng 1.31.3奖人工合成胰岛素就成了一项世界性的热门课题据，1955- ，在世界范围内共有10研究1958年开始研究，1965年，中国世界上首次成功人工合成胰岛素， 了中国科学工作者历经八年的科研关，夺得了这项科学竞赛的“世界冠军”。1.3蛋白质顺序测定基1.3鉴定多肽链的N-末端和C1.3鉴定多肽链的N-末端和C利 肽重建完整多肽链的一级结1.3多聚蛋白质（杂多聚蛋白质）:：8mol/L，6mol/L1.31.31.3.3.二硫键的过甲酸氧化法：将二硫键氧化成磺酸基1.31.31.3.4.完全水解：酸水解是主要方法，多用HCl，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu。---计算各种氨基酸残基的数目或比例R+HNCHRSOHNCH RSOHNCHC1.31.3.5.鉴定多肽链的N-末端和C-末二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH与DNFB反应生DNP-肽，最后水解生成黄色DNP-氨基N-末端测丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基丹磺酰氯（DNS）法(强荧光，检测灵敏度可以达到1X10-CH CHCH CHBrS+C甲基硫酸HCSC....NCCHNHHHCO...NCCN+H 溴化亚氨内酯....NCCNH CHC...NCCHH++HNO肽酰高丝氨酸内酯(C-末端肽段)(N-末端肽段)1.31.3.5N-末端和C肼解法：最重要，肽与肼反应，除C-末端氨基酸，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物。肼化物能够与苯缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。羧肽酶AProArg羧肽酶法：最有效、羧肽酶B:Arg羧肽酶HO HOOHNCCNCNHCCNCCNHCCHRRR100HNCCNHNH +HNCCNHNH+NHCCHHH n-1个氨基酸酰 氨基1.31.3.6. 糜蛋白酶(chymotrypsin)：断裂Tyr，Leu酶裂解：胃蛋白酶(pepsin)：在酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时，常用到此酶。葡萄球菌蛋白酶(thermolysin)：专一断裂Glu（化学裂解：溴化（CNBr）：只断裂Met1.3.61.3.6.多肽链的裂解溴化水解法：选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的1.31.3.7.测定各肽段的氨基酸(1)Edan化学降解法：用Edman试剂PC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解，一次可连续测出60-0个氨基酸基的序列；作量大，作麻烦；现改用蛋白质 仪。肽段的基 (2)由核苷酸序列推定(3)质谱法1.31.31.3.7.(1)Edman化学降解法：偶联反 转化反 1.3例如：知道一部分氨基酸序列就容易找到并分离相应 建立蛋白质数据库 蛋白质信息库序列数欧洲欧洲分子生物学数据1.31.3.7.质谱仪能够准确地测量肽段和蛋白质的相对分子量、氨基酸序列及翻译后修饰等结构信息，甚至可以对蛋白质进行相对或者绝对定量。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技1.31.3.7.质谱仪能够准确地测量肽段和蛋白质的相对分子量、氨基酸序列及翻译后修饰等结构信息，甚至可以对蛋白质进行相对或者绝对定量。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技质谱技术能快速的鉴定大量的蛋白质，并且质谱技术的灵敏度也非常高。质谱技术的这些优点使其成为蛋白质组学领域的主流技术。1.31.3.7.通通过测定电离后的肽段或者其碎片离子的质荷（m/z）来对蛋白质的组成成分和结构进行分析基质辅助激光解吸电离飞行（MALDI-TOF-电喷雾电离质谱(ESI-MALDI-TOF-基本原理：将分析物分散在基质(Matrx)分子中并形成共结晶,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量与样品解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离基质的–相,。MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关离子化效率高，是现今灵敏度最高的质谱仪质量分析范围：800Da---基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。电喷雾电离产生多电荷峰，质谱图显示离子带不荷数的一系列质荷比峰[n+，根据这些峰值换算出离子电荷和分子质量。肽质量谱（PeptideMass肽质量谱（PeptideMassFingerprint， 谱（PeptideFragmentFingerprint，可以提确结构信息，一般是对蛋白未分离或分离效果差的样品。串联质谱可以提 确结构信息，一般是对蛋白未分离或分离效果差的样品。第一级质量分析器起质量过滤器的作用，从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子进入碰撞室，母离子在碰撞室内经高流速惰性气体碰撞诱导离解产生碎片离子/ 搜库是目前主要的数据处理把实验图谱与数据库中的每个肽段的理论图谱进行比较并且按照一定的打分算法进行打分，最后给出匹配最好的肽段或者是肽段列表。这种方法假设要鉴定的肽段在数据库中是存在的。这种方法是有效的并且已经成功应用于几个蛋白质组计划。这种方法不适用于目标序列不存在于数据库中的情况，如目标序列来源于一种新的蛋白质，存在翻译后修饰或者DNA错误。通过直接分析串联质谱数据而得到肽段序列，而不需要搜索数据库。理论上，如果肽段的碎裂是完全的（即肽段的每个肽键都碎裂产生碎裂碎片），那么我们可以通过计算同一种离子类型中相邻碎片的质荷比差值而得到整个肽段的序列。1.31.3.8.肽：由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同，产生的切口彼此错位，使两套肽段正好跨过切口而的肽段；获得肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品，得到两套或多套肽段例1.31.3.9.胃蛋白酶水解含二硫键的蛋白质。胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定第一向电 甲酸氧化（S-S断裂1.3鉴定多肽链的N-末端和C利 肽重建完整多肽链的一级结1.41.41.4化学家RobertBruceMerrifield由于肽的固相合成方法，这在方法学上是一个重大的破，所以他获得了1984化学1.41.4总结:肽的理化蛋白质一级结构肽的固相1酸水解和氨基酸组成为Ala21酸水解和氨基酸组成为Ala2Arg，Lys2，Phe，Ser羧肽酶A水解得一氨基酸为胰蛋白酶水解得四个肽段，其氨基酸组成如下：①Ala，Arg②Lys，Phe，Ser③Lys④A1a，Met，溴化水解得两个肽段，其氨基酸组成如下Arg，Ala，Met，Phe，Ser②A1a，Ser①A1a，Arg，Ser②Ala，Lys，Met，Phe，Ser 第四组：肖庆宇 、吴雪静、王洋