感受态制备及电转化

感受态感受态即应用各种理化方法处理诱导细胞，使其最适合摄取和外DNA的生理状态，此时的细胞称为感受态细胞。克隆感受态：JM109TG1表达感受态：BL21需准备的器材和试剂：1.5mLEP管一盒，蓝，黄枪头各一盒，移液管若干，求配置）LB液体培养基。大肠杆菌感受态的方法：CaCl2法，TFB法，TSS一步法，Inoue效法等，最常用的方法就是CaCl2法。下面具体介绍CaCl2法。CaCl2法感受态的原理0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变DNADNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞CaCl2法感受态的步骤1ml100mlLB37℃200～300r/min250ml10～20min3、4℃4000r/min10min410ml0.1mol/LCaCl220min5、4℃，4000r/min10min650ml2ml0.1mol/LCaCl2-14%甘油溶液重悬每份7、将重悬的菌液分装至灭菌预冷的EP管，每管100～200µL,-80℃备用。需要准备洗液EPB，和EPWB从37℃培养24～30h的新鲜平板中挑取一个单菌落，37℃静置培养16～20h，1ml100ml2%甘氨酸的MRS或M17扩大培养37℃4～6h1hOD600OD6000.4～0.8。50ml10～20min4℃3500r/min10min20ml冰预冷的EPWB溶液重悬菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集20ml冰预冷的EPWB溶液重悬菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收20ml冰预冷的EPB溶液重悬菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集细20ml冰预冷的EPB溶液重悬菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集100ml2ml冰预冷的EPBEP0.8CaCl2溶液：200ml2.22gCaCl2 EPWB溶液 200ml,调PH7.4 EPB溶液 蔗 200ml,调PH7.4转化指同源或异源的“露”DNA分子被感受态细胞摄取并得到表达的DNA和蛋白质，不可能自由通过质膜。电穿孔术利用磷脂双层疏水与亲水基团电转杯（平时泡在75%的中）紫外灯下照2h以上，盖好盖子，置于新PE手套内，-20℃30minDNA0.5-1mm电击杯：100 2mm电击杯：200微升DNA的混合物转至预冷的电击杯中，电击杯放入滑板中，将滑板推1ml恢复培养基，轻柔混合，再将混合物吸出加入4mL恢复培养基中，37℃2-3h。6.1mL800μl，重悬菌体，涂布相应抗性的平板。氨苄霉素抗性：1mL培养基+2μl氨苄霉素溶液卡那霉素抗性：1mL培养基+5μl卡那霉素溶液氯霉素抗性：1mL培养基+1μl氯霉素溶液DNA样品和感受态细胞溶液一定要低电阻.可以用无水乙醇和醋酸钠洗涤连接产物DNA纯度最好高,否则影响转化细胞恢复保证电击杯预冷并干燥.在室温条件下电击,100迅速加入恢复培养基,DNA分子过饱和，反而不利于转化。DNA1min孵育时间在2h内随着孵育时间变长而转化效率提高，但高于2小时后，延长电压:球菌2-2.5kv杆菌1.6-2kv电击