高效毛细管电泳-2

四.HPCE操作模式HPCE各种方式方式 分离依据 毛细管区带电泳 自由溶液的淌度 胶束电动色谱 与胶束间的疏水性/离子性相互作用毛细管凝胶电泳 大小和电荷 等电聚焦 等电点 等速电泳 移动界面（一）毛细管区带电泳（特点）

Capillaryzoneelectrophoresis操作简单、多样化应用广溶质以不同的速率在分立的区带内迁移而分离EOF存在1.选择性和添加剂的使用（1）缓冲液的选择种类pH浓度①种类——选择缓冲溶液原则较强缓冲能力；低紫外吸收；小淌度②缓冲溶液的pHpH改变改变溶质所带电荷（pH低于

pI，pH高于

pI）伴随EOF变化导致选择性差异HPLC收集到的多肽在

CZE中的流出顺序（2）添加剂——表面活性剂多种SDS，CTAB，BRIJ，TWEEN临界胶束浓度（CMC）与溶质相互作用吸附在毛细管内壁，改变EOF（2）添加剂——手性选择剂环糊精，冠醚，胆汁酸盐CDsHO（3）温度对CZE分离影响改变粘度改变EOF改变分析时间改变化学平衡和动力学2.毛细管内壁改性溶质与毛细管内壁的相互作用，使分离效率降低采用极端pH高离子强度缓冲溶液内壁改性（静态改性、动态改性）（1）内壁静态改性形成键合相或粘合相聚合物与硅醇基反应（2）毛细管内壁动态改性改良剂直接加到操作缓冲溶液中优点：改变其电荷和疏水性缺点：溶质和毛细管内壁同时受影响；平衡时间要长3.CZE的应用生物学领域：多肽和蛋白质的分析（二）胶束电动色谱Micellar

electreokineticcapillarychromatography(MEKC,MECC)1984,Terabe电泳技术与色谱技术的交叉优势：分离中性溶质、带电组分缓冲溶液中加表面活性剂表面活性剂非离子型：聚乙二醇，司盘，吐温离子型：阴离子型C12H25SO4-Na+(SDS)；阳离子型C18H37NH3+Cl-；两性：RNH2CHCOOH1.原理（1）概述胶束假固定相（与色谱类似），流动相胶束迁移方向，EOF方向一般EOF的移动比胶束迁移快分离机理：基于胶束与中性分子间的相互作用。（2）容量因子（3）分离度2.如何提高分离度K’：随表面活性剂浓度增加而线性增加，但会增大EOF扩大洗脱范围或时间窗口可提高分离度*采用中等程度的EOF和高迁移率的胶束MEKC中中性溶质的

流出时间窗口3.分离条件的优化控制选择性（使用不同表面活性剂，改变缓冲液浓度、pH、温度及使用添加剂）加有机修饰剂控制溶质——胶束间的相互作用4.MEKC的应用氨基酸、核酸、维生素、药物等MEKC分离治疗

感冒药物的成分（三）毛细管凝胶电泳Capillarygelelectrophoresis1.原理基于分子尺寸，让溶质在合适的起“分子筛”作用的聚合物内进行电泳而分离。又称毛细管筛分电泳筛分介质（凝胶材料——聚丙烯酰胺）2.CGE的应用对DNA分离具有极高的效率分子生物学：寡聚核苷酸纯化反应基因疗法

DNA测序和PCR产物分析（四）毛细管等电聚焦Capillaryisoelectricfocusing(CIEF)1.原理依据pI不同分离毛细管中加入两性电解质建立pH梯度。阴极（放到碱液中），阳极（酸液），加电压，组分迁移，直到它们到达一个不带电的区域（在其pI处），聚焦。2.CIEF的应用测定蛋白质等电点，分离异构体等五.HPCE的仪器及操作（一）进样进样:区带长度<毛细管总长度的1－2％。样品超载，对分离度不利（峰变宽、峰形畸变）两种进样方式：流体力学、电动流体力学：用压力和时间；电动：电压和时间。进样体积——Hagen—Poiseuille△P=加在毛细管两端的压力差d=毛细管内径t=进样时间η=缓冲溶液的粘度L=毛细管的总长度（二）分离毛细管恒温系统电源1.毛细管熔融石英检测窗口：除去聚酸亚胺保护层①老化老化影响重现性。用碱液洗去表面的吸附物（用1NNaOH→0.1N的NaOH溶液和缓冲溶液冲洗）②恒温重现性：控制毛细管温度。常用方法：用高速气流和液体恒温。2.高压电源使电压稳定在上0.1％。3.迁移时间/淌度的重现性＜0.5%RSD。毛细管壁缓冲溶液的组成p