基因克隆基础知识

RT-PCR逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptII。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择.随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。.Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3′端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。.特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。二、试剂准备RMA提取试剂第一链cDNA合成试剂盒dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mMTaqDNA聚合酶三、操作步骤.总RNA的提取：见相关内容。2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。(1)在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5^g,补充适量的DEPCH2O使总体积达11出。在管中加10^MOligo(dT)12-181比，轻轻混匀、离心。(2)70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10xPCRbuffer2比25mMMgCl22出10mMdNTPmix1出0.1MDTT2出轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。(3)加入SuperscriptII1出，在42℃水浴中孵育50min。(4)于70℃加热15min以终止反应。(5)将管插入冰中，加入RNaseH1出，37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。3．PCR：(1)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2出上游引物(10pM)2比下游引物(10pM)2比dNTP(2mM)4出10xPCRbuffer5出Taq酶(2u/M)1比(2)加入适量的ddH2O,使总体积达50比。轻轻混匀，离心。(3)设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G3PD)的特异性引物，同时扩增内参DNA,作为对照。(4)电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。(5)密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。.内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、0-Actin(快肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。.防止DNA的污染：(1)采用DNA酶处理RNA样品。(2)在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。百合鳞片总提取方法的比较杜运鹏李双何恒斌杨爽贾桂霞【摘要】：为了筛选出适合百合鳞片的总RNA的提取方法，本研究以东方百合品种Siberia的鳞片为材料，比较了Trizol法、改良Trizol法、RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取RNA的效果。结果表明:Trizol法、改良Trizol法及RNAplantplusReagent提取试剂盒均不能提取到完整的RNA;离心柱型植物总RNA提取试剂盒存在DNA污染;改良CTAB法能有效去除多糖,28S条带的荧光亮度是18S条带的1.5〜2倍,D260/D280值都在1.9〜2.1之间,D260/D230值大于2,两个样品的平均得率分别为103.57%/g和119.21%值,说明此方法适合百合鳞片RNA的提取。RT-PCR结果扩增出了特异性条带,说明改良CTAB法从百合鳞片中提取的RNA质量高、完整性好、产率高，完全可以用于后续的分子生物学实验。灰绿藜RNA提取方法及在cDNA文库构建中的应用摘要:目的：为分离灰绿藜耐盐相关新基因，构建叶片cDNA文库，探索从盐生植物中提取高质量RNA的方法。方法：以灰绿藜叶片为材料，应用RNAPlantReagent法(Tiangen)、PlantRNApurificationReagent法(Invitrogen)、UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法(Sangon)、SDS-LiCl法、TRIZOL试剂法(Invitrogen)等进行总RNA的提取，并构建其全长cDNA文库和抑制消减文库。结果：RNAPlantReagent法、PlantRNApurificationReagent法和UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法获得的RNA完整性均不好;SDS-LiCl法提取的RNA完整性好(28S条带亮度是18S的2倍、条带锐利清晰)、纯度高(A250/A260为1.89±0.03,A260/A230为2.23±0.02),适合用于直接反转录及构建全长cDNA文库，并获得成功；TRIZOL试剂法简单快捷，产率高(22±82/@),完整性较好，可经mRNA纯化后用于抑制消减文库的构建并获得成功。结论：建立了用于构建高质量cDNA文库的灰绿藜RNA的制备方法。CDNA构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与九噬菌体臂的连接详解一).构建cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板,用逆转录酶合成互补的双链cDNA,然后接到载体上,转入到宿主后建立的基因文库就是cDNA文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1)总RNA的提取RNA提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2)mRNA的分离高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，将总RNA通过寡聚(DT)纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。mRNA的纯化①按照大小对总mRNA进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4)mRNA完整性的确定确定mRNA完整性的方法有三种：直接检测mRNA分子的大小；测定mRNA的转译能力；检测总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。cDNA的合成和克隆cDNA第一链的合成用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo(dT)与纯化的mRNA混合，oligo(dT)会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条RNA-DNA的杂交链。oligo(dT)结合在mRNA的3'端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是mRNA链很长时，为此建立了一种随机引物法合成cDNA。随机引物是一种长度为6~10个核苷酸，由4种碱基随机组成的DNA片段。与oligo(dT)仅与mRNA3'端结合不同，它们可以在mRNA的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。把cDNA克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的RNA转变成DNA链，即形成双链DNA分子。.双链cDNA的合成合成cDNA第二条链有两种方法。一种方法是利用cDNA第一链的3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环，可以用单链特异的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的处理，常常会“修剪”过多的cDNA顺序，使cDNA丢失了mRNA5'端的部分顺序。另一种方法是用大肠杆菌的RNaseH进行修饰。RNaseH能识别RNA-DNA杂交分子并把其中的RNA切割成短的片段，这些RNA短片段仍与cDNA第一链结合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA链。RNaseH法优于S1核酸酶法，它能获得包括mRNA5'端全部或绝大部分的更长顺序cDNA分子。将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；通过粘性末端连接。.转化重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。.目的cDNA克隆的鉴定用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：①核酸杂交②免疫学杂交检测③cDNA同胞选择近年来随着生物技术的不断发展出，现了许多克隆新基因的方法和手段如，图谱克隆技术、转座子标签技术、差异显示技术二基因组减法技术以及文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。末端快速扩增技术（i）是一种基于从低丰度的转录本中快速扩增的和末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的技术是由等a）发明的一项技术，主要通过技术由已知部分序列来得到完整的和端，包括单边和锚定R该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（等，9e：,9等，9等）。对传统技术的改进主要是引物设计及技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（）合成第一链，即在（）引物的端引入两个简并的核苷酸【（）60,/】，使引物定位在（）尾的起始点，从而消除了在合成第一条链时（）与（）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在端加尾时，采用（），而不是（）；改进之三是采用莫洛尼氏鼠白血。病毒（）反转录酶或选择嗜热聚合酶可能在高温（60℃70℃）有效地逆转录，从而消除了端由于高含量导致的二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动（r技术和降落（）提高反应的特异性。随着技术日益完善，目前己有商业化技术产品推出，如的技术和技术。邢桂春等（0先后使用上述两种试剂盒进行反应，结果发现使用所得到的片断总是比采用试剂盒到所得到的片断短。其原因在于技术反转录反应往往不能真正达到的末端。所以认为，进行反应应当优选试剂盒。以下就国内目前应用最广的试剂盒为例，简要概述技术的原理和操作过程。的原理TOC\o"1-5"\h\z利用的末端的（）尾巴作为一个引物结合位点，以连有寡核营酸序列通用接头引物的（）作为锁定引物反转录合成标准第一链然后用一个基因特异引物（，）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物（，）作为下游引物，以第一链为模板，进行循环，把目的基因末端的片段扩增出来。（见）3'-RACE-ltead^DNArRACEPCRFirstfound&fPtRGene-specrfic鼻M曲白吕除3'-RACE-ltead^DNArRACEPCRFirstfound&fPtRGene-specrfic鼻M曲白吕除Slandard1irsl-&trand卬nth”诃・B口SMAfilIIAsequenceNextroundsofPCRIncorperutiQnofsuppressionPCRinvertedrap&atdHments:匚=bfLungUiivarsalPrimerDouUe-stranded3'-RACEfragmentRenisiningroundsofPCRimplrficanonc«f3'fragment的原理TOC\o"1-5"\h\z先利用的末端的l）尾巴作为一个引物结合位点，以（）作为锁定引物在反转录酶作用下，反转录合成标准第一链利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3个（C残基，退火后（C残基与含有寡核苷酸序列（）通用接头引物配对后，转换为以序列为模板继续延伸而连上通用接头（见）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物（r）作为上游引物，用一个基因特异引物（，）作为下游引物，以第一链为模板，进行循环，把目的基因末端的片段扩增出来。最终，从个有相互重叠序列的产物中获得全长N或者通过分析产物的和端序列，合成相应引物扩增出全长。B口SMART™fimr日nds.ynlhBsitKtB口SMART™fimr日nds.ynlhBsitKttemplateswitching5-RACEPCRSecondr